荧光定量PCR，模板浓度够高，CT仍30多，原因何在...

什么没看
tm值是否为单峰，调整为低浓度，或者倍比稀释看看，浓度大有时候并不是好事

是单峰的，稀释了10后，内参的CT值又大了

chixinzero
你的cDNA浓度是怎么测出来的？一般测的不是RNA浓度嘛？cDNA因为反转的加入了很多dNTP所以不准的

Mis願

我是反转录后测的cDNA浓度。是从六孔板一空的细胞用trizol 提的RNA，是细胞太少了吗？有一次也测过RNA，浓度有700 ng/ml左右，但没做PCR。

chixinzero

你在反转的时候，其实加入的很多的dNTP，但是测浓度的原理，也是测碱基的含量，所以你测cDNA的浓度肯定不对的，还有就是一般我们反转都会测完RNA浓度后统一配平到一个浓度，以此来确定cDNA浓度

配平具体怎么做，怎么来确定cDNA的浓度。对咯，我是做相对定量的，这个有关系吗？

Mis願
real time RT-PCR，测了模板cDNA浓度1800ng/ml，纯度在1.96左右，但是检测内参GAPDH，CT值都有30多，目的基因的CT更大了。请问问题在哪里，CT值大不就是因为模板量不够吗，可是现在这个浓度显然是充足的，怎么解释？

Mis願
real time RT-PCR，测了模板cDNA浓度1800ng/ml，纯度在1.96左右，但是检测内参GAPDH，CT值都有30多，目的基因的CT更大了。请问问题在哪里，CT值大不就是因为模板量不够吗，可是现在这个浓度显然是充足的，怎么解释？

溶解曲线单峰，那么温度值是多少？如果低于80很有可能都是引物二聚体，有没有阴性对照？看阴性对照的值和样品值是否相近。内参都那么大的值，很怀疑模板有问题，或者引物有问题啊，你可以先跑个普通pcr试试，看看能否跑出单一目的条带