荧光定量pcr的ct值偏高如何解决...

kenna

组织用Trizol法提取总RNA浓度、纯度都很好，但逆转录后跑PCR，CT值偏高，内参的在22-27之间，目的基因在30-36之间，不知道是怎么回事，如何来解决，求高手赐教。我用的Takara的试剂盒。

一般组织或临床样本的CT值会比细胞的高一点，但你这个有点太高！有几个可能性。

1、最有可能是RNA降解严重，按你的ct值来看，可能10%的RNA都降解了。建议电泳看看RNA是不是降解比较严重。

2、逆转可能出问题，可能是逆转试剂有问题，也可能逆转程序没设置好，也可能是逆转前RNA没有预热变性。建议重新收个细胞抽RNA按标准程序逆转一下，看看ct值会不会正常。

3、有DNA污染，不知道你是怎么抽提的，组织研磨之后有没有用PBS洗，可能在抽提的时候有DNA混进去了，如果担心有DNA酶污染就用DNASE I处理一下再逆转。

祝实验顺利，欢迎随时交流探讨

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wusofa

一般组织或临床样本的CT值会比细胞的高一点，但你这个有点太高！有几个可能性。

1、最有可能是RNA降解严重，按你的ct值来看，可能10%的RNA都降解了。建议电泳看看RNA是不是降解比较严重。

2、逆转可能出问题，可能是逆转试剂有问题，也可能逆转程序没设置好，也可能是逆转前RNA没有预热变性。建议重新收个细胞抽RNA按标准程序逆转一下，看看ct值会不会正常。

3、有DNA污染，不知道你是怎么抽提的，组织研磨之后有没有用PBS洗，可能在抽提的时候有DNA混进去了，如果担心有DNA酶污染就用DNASE I处理一下再逆转。

祝实验顺利，欢迎随时交流探讨

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我是提完RNA接着逆转的，难道这么快就降解了。我用的takara的RNAiso Plus，是不是不太适合提组织的？别人提的细胞rna做的都很好。我自己也觉得逆转录做的不是很好，因为是用金属浴完成的，感觉不是很标准（但是别人也是用这种方法也没出现我的问题），我用的takara的逆转录试剂盒有一步去DNA酶反应。非常感谢您的指导，我再逐步排除一下吧。

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kenna

我是提完RNA接着逆转的，难道这么快就降解了。我用的takara的RNAiso Plus，是不是不太适合提组织的？别人提的细胞rna做的都很好。我自己也觉得逆转录做的不是很好，因为是用金属浴完成的，感觉不是很标准（但是别人也是用这种方法也没出现我的问题），我用的takara的逆转录试剂盒有一步去DNA酶反应。非常感谢您的指导，我再逐步排除一下吧。

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调整一下引物浓度和模板浓度试试