如何通过化学修饰来测定酶的活性中心...

如何通过化学修饰来测定酶的活性中心

测定酶活性中心组成和结构是研究酶催化作用的重要课题。目前常用方法有：化学修饰法、反应动力学法、X－射线衍射法等。1.化学修饰法：此方法是研究最早，应用最广泛的方法。原则上讲，酶分子侧链上的各种基团，如羧基、羟基、巯基和咪唑基等均可由特定的化学试剂进行共价修饰。当它被某一化学试剂修饰后，若酶活性显著下降或丧失，则可初步推断该基团为酶的必需基团。2.动力学分析法：酶蛋白是含有许多解离基团的两性电解质，pH改变必然影响到解离基团的解离状态，处于活性中心基团的解离状态的改变必然影响到酶的活性。因此，通过研究酶活性与pH关系，可以推测到与催化直接相关的某些基团的pK值，进而推测这些基团的作用。另外，改变反应温度求出Vmax和Km与pH关系，从而求出有关基因解离的DH，DH的求得有助于补充pK值对活性中心的判断。在有机溶剂存在条件下，测定酶pK值与介电常数的关系，也有助于对活性部位的判断。3.X－射线衍射分析法：化学修饰法和动力学分析只能推断酶活性部位氨基酸残基的数目，活性中心空间结构的信息，则需用X－射线衍射法。采用X射线衍射法在研究酶活性中心空间构象时，通常是将酶与底物类似物或专一性抑制剂形成复合物，而后作X－射线衍射分析，从而得到有关酶活性中心构象、酶与底物的接触状况以及催化机理的信息。4.蛋白质工程：蛋白质工程是近年来发展的研究酶必需基团和活性中心的最先进的方法。蛋白质工程实质是按照人们的设想，通过改变基因来改变蛋白质的结构，制造新的蛋白质。利用基因定点突变技术将酶相应的互补DNA（cDNA）基因定点突变，突变的cDNA表达出被一个或几个氨基酸置换的酶蛋白，再测定其活性就可以知道被置换的氨基酸是否为酶活性所必需。此方法可改变酶蛋白中任一氨基酸而不影响其他同类残基和不引起底物和活性中心结合的立体障碍，以及可人工地造成一个或几个氨基酸的缺失或插入，了解肽链的缩短或延长对酶活性的影响和定点改变酶蛋白的糖基化位点或磷酸化位点，从而了解糖基化或磷酸化对酶结构和功能的影响。