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2017-10-05 00:02
目前用于EGFR基因突变检测的主要方法有直接测序法、AEMS、DHPLC、HRM、PCR-SSCP、突变富集体PCR及微数字PCR等。下面将对这些检测方法进行简单介绍：
1、直接测序法 直接测序法利用的是Sanger测序法的原理，是目前公认的进行EGFR基因突变检测的金标准。其优势在于相对成本较低，非常直观，可以直接读出DNA的碱基序列，对于已知和未知的突变均可以进行检测。其缺点在于需要对测序样品扩增、纯化、序列分析，过程比较繁琐、耗时长，且对取材和技术要求比较高,对环境和操作者有危害。更重要的是直接测序法灵敏度有限，肿瘤组织的突变含量至少达到20%才能被直接测序法检出。 2、焦磷酸测序法（Pyrosequencing） 焦磷酸测序技术是新一代的DNA序列分析技术，其原理是在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到新合成的DNA链中并释放出焦磷酸基团(PPi)。经过一系列的酶级联化学发光反应，PPi转化为可见光信号，而信号的强度与反应中掺入的核苷酸数目成正比。因此，无需电泳无需对DNA片段进行荧光标记，就可以快速、准确地测定一段较短的目标片段。其不足在于不如直接测序普及，测序长度短，易污染。 3、探针扩增阻滞突变系统（amplification refractory mutation system，ARMS） 原理为：利用Taq DNA聚合酶缺少3'→5'外切酶活性，PCR引物的3'端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增的原理，针对不同的已知突变, 设计适当的引物以检测出突变基因。该法在设计引物时，在引物3'端设计一错配碱基，一个与野生DNA 互补，一个与突变DNA 互补，使之仅能与突变型或野生型互补而只扩增突变型或野生型基因。扩增后的PCR产物可通过实时荧光定量PCR（real-time PCR）进行定量分析。目前已有两种较为成熟的商品化试剂盒问世，一种是英国DxS公司生产的DxS ARMS EGFR检测试剂盒，另一种是我国厦门艾德生物医药科技有限公司生产的Adx ARMS EGFR检测试剂盒，二者均可检测29种常见突变。前者使用的是蝎形探针，后者是双环探针。ARMS法较直接测序法的敏感性更高，其检测结果与临床疗效的一致性更好，纤维支气管镜活检等小标本和血浆或血清标本的EGFR突变检测更适合用ARMS法。但ARMS法需要特殊探针，每次仅能检测一种突变。 4、变性高效液相色谱法(denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC) DHPLC是利用发生错配的杂合双链DNA与纯合双链DNA解链特征的差异将它们分离开来。由于杂合双链DNA错配位点处氢键被破坏而形成“鼓泡”，在部分加热变性的条件下，更易于解链形成Y形结构，与固定相的结合能力降低，所以杂合双链将先于纯合双链被洗脱出来，通过洗脱峰的不同就可判断是否有突变存在。与测序法相比，DHPILC简单、快速、敏感性高，不仅可用于已知突变的检测，还可以用于未知突变的扫描。DHPLC不足之处：只能检测有无突变，不能检测出同源突变和突变类型。结果判读容易出错，且当有多个片段需要检测时，由于有多个解链温度，需要多步检测，增加了工作量。 5、高分辨率熔解曲线分析技术(high resolution melting analysis，HRM) 利用不同长度或不同碱基组成的DNA序列熔解曲线不同，在PCR后直接运行高分辨熔解进行样品突变分析，应用其极高的温度均一性和温度分辨率，可对0.1℃差异进行分辨，使分辨精度达到对单个碱基差异的区分。每一段DNA，因组成的碱基不同，形成独特的熔解曲线，如同DNA指纹图谱一样，具有很高的敏感性、特异性、稳定性和重复性。与测序法比较，灵敏度高，可用于体细胞突变的检测和测序前突变的筛选。该方法无需序列特异性探针，也不受突变碱基位点与类型的局限，操作简单，无需PCR后续操作，选择性好。但该法只能分析纯度单一的小片段DNA，且要求有足够的模板，模板含量不少于1ng时能得到稳定可靠的结果。 6、聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-Single strand conformation polymorphism analysis，PCR-SSCP) 单链构象多态性是指单链DNA由于有链内碱基配对而具有一定的空间构象，当碱基发生改变时，单链DNA的会形成不同的构象。在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳时，单链DNA迁移率除与DNA长度有关外，更主要取决于DNA单链所形成的空间构象，相同长度的单链 |
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