关于全长cDNA文库构建试剂盒的问题...

关于全长cDNA文库构建试剂盒的问题

我用过Clonetech公司的SMART cDNA Library Construction Kit，Cat.No.K1051-1，效果挺好的，就是价格高7000圆人民币左右（2003年9月的价位），而且只能完整做5次（总RNA到第一链cDNA合成），PCR可以做15次，另外要提醒的是它不含噬菌体包装蛋白（Lambda DNA Packaging System）,如果你要建噬菌体文库，这是必须的，我当初买的普洛麦格（Promega公司）的k3154,效果还行，就是太少（6 extracts）。
还有，做时不能完全安说明书来做，要根据自己的情况来决定具体的时间，否则永远都做不出来的，祝你好运！

谢谢agarose313
以后有问题会继续请教

“请教”二字可不敢当，共同探讨，共同进步！

请教agarose313 ，我现在也在用这个kit建库，不过合成的cDNA亮度不好，可是smear的长度还是可以的。这是怎么回事？我pcr已经用了24个循环了。

如果中间有明显亮带的话，就说明没有Overcycled，可以继续增加循环次数，我用的是30次循环。能否告知你的目的基因预测长度（因为建库的目的就是为了筛库来捕获目的基因）、变性时间和延长时间？ 你可以先试着用30cycles,不行就延长变性时间或者先加一个95℃，80sec的预变性，我当初从20cycles到30cycles，没有明显改变，后来大幅延长变性时间，才看到又亮又长的条带。你试一下先好啦。

昨晚我忘了说，你把产物量不高的那管pcr从-20℃取出来，追加一个95℃，80sec，6cycles（你的循环），如果循环次数不够是瓶颈环节的话，产物量会大幅提升，不过我没见你的图，不知道你所说的smear够长是多长，据我的一点经验，瓶颈环节应该是变性时间太短。

哦。谢谢。我是完全按照说明书做的。因为目前还没有要筛的基因，所以计划是要普遍筛的。我的smear是从100～5kb。你的意思是要追加95℃ 80s然后再进行6个95℃ 5s，68℃ 6min的循环吗？你能告诉我你的邮箱吗？我把图发给你看看吧。我不知道如何在这里贴图。

我的邮箱是lixj521@sina.com.cn如果你是完全按照说明书做的，而且smear又是从100~5K，亮度又不好，那和我开始做的征状相同，明显变性时间不够，追加循环是没有用的，建议将那管pcr从-20℃取出来，按下面的program再做一次（虽然它自己很没有信心地说它的Taq酶在95℃的Half-life为20～40min，但实践证明要大于此值）
预测目的gene为1－5kb：
●95℃ for 1min20sec
●25cycles
95℃ for 50sec
68℃ for 6min
●68℃ for 10min

谢谢agarose313。我先这样做一下。不过由于前面提的只是用DEPC处理水溶解后存于－70的，所以现在我的RNA有所降解，要重新提取。不知对于rna保存，你有什么高招吗？我上次用的rna只存了2个月就不好了。难道是提取的问题吗？可是我用的tip头ep管都严格处理了呀。

一次合成的cDNA第一链有10μl，而一次PCR只用2μl，怎么会用完。就是用完了也没有关系呀，把它们从-20℃ 冰箱中拿出来，就认为它们是新配好的PCR体系，直接放在PCR机里跑好啦，我试过的，结果影响不大。
做RT-PCR最好用新鲜的RNA，超过一周即使没有降解我也不用。

下面是我提RNA的一点体会，对于保存RNA我也没有办法：
1）如果枪头和EP管是刚拆包的，就无需DEPC处理，处理后反而会破坏？硅化涂层？导致取液不准和挂液；镊子、装EP管的饭盒等要先用DEPC处理，然后再一起高温灭菌；
2）戴橡胶手套，常用95%的酒精擦手、离心机、实验时用到的EP管架和实验操作区域。不要对着实验区域说话；离心时不能完全按说明书上写的时间，如果离心完管里还有液体就再离心一会。
3）提到RNA后取一点测比值和浓度，然后立即开始下面的实验。