【求助】请问RNA试剂盒的作用？...

【求助】请问RNA试剂盒的作用？

@一切平安 ，实验方法见TRIzol RNA提取方法

总RNA（totalRNA）和信使RNA(mRNA)的抽提（自己的总结）
总RNA纯化系统采用两种著名的RNA酶抑制剂,异硫氰酸弧(GTC)和β-巯基乙醇,加上整个操作都在冰浴下进行,这样就能显著降低RNA的降解速率。GTC和N-十二烷基肌氨酸钠的联合使用,将促使核蛋白复合体的解离,使RNA与蛋白质分离,并将RNA释放到溶液中。而进一步从复合体中纯化RNA,则根据Chomczynski和Sacchi的一步快速抽提法进行,采用酸性酚-氯仿混合液抽提。低pH值的酚将使RNA进入水相,这样使其与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离。水相中的RNA可用异丙醇沉淀浓缩。进一步将上述RNA沉淀复溶于GTC溶液中，接着用异丙醇进行二次沉淀，随后用乙醇洗涤沉淀，即可去除所有残留的蛋白质和无机盐，而RNA中如含无机盐,则有可能对以后操作中的一些酶促反应产生抑制。

4、mRNA的应用(了解内容)：
RT-PCR, Northern杂交，cDNA文库构建,mRNA末端快速扩增(RACE)，差异表达(DDRT-PCR)，引物延伸反应(PrimerExtension)，体外转录(In VitroRNA Transcription), RNA标记(RNAlabeling)，RNA酶保护试验(RNaseand S1 Nuclease Protection Assay)，RNA微注射(RNAMicroinjection)

RNA提得比较好的话，电泳后28S rRNA和18S rRNA应当能清楚地在紫外灯下看到。甚至可以看到一条由tRNA, 5.8S rRNA和5S rRNA组成的，较模糊迁移较快的带。如果RNA没有被降解，28S rRNA的亮度应该是18S rRNA亮度的两倍。加样孔附近有条带表明产物中仍然有DNA存在。



提取总RNA后用分光光度计测其OD260和OD280的值进行定量。具体方法是：取1ml水进行调零，然后取4 ulRNA和996 ul水测OD260和OD280的值。其中OD260/OD280的值是你所得RNA的纯度，OD260×10的值是你所测RNA的浓度，最后用水稀释到1 ug/ul。具体稀释方法是：加水的量＝OD260×10×（溶RNA加水的量－取出测RNA浓度所消耗的RNA体积）－（溶RNA加水的量－取出测RNA浓度所消耗的RNA体积）。一般分光光度计测得比较准确，除非你最后溶解RNA时RNA没有充分溶解，导致误差大。你可以多测几次取个平均值



稀释倍数可以自己控制，比色杯总量100ul，我是取5ulRNA和95 ul水测OD260和OD280的值，这样我检测的浓度就要比我原溶液的浓度稀释了20倍。
RNA样本的浓度（ug/ul)＝OD260*10*20
OD260/OD280的值在1.6-1.8说明RNA纯度高



RNA 电泳情况：

RNA一般有3条带，从上到下，分别是28S，18S，5S，三条带清晰没有拖带的现象是最好的，有时5S不太亮或略有拖尾也可以，但是如果5S比28S和18S亮说明有降解。
3 电泳时室温不宜太高或电泳不能跑的太长，否则RNA容易降解

一般提取RNA后我们会取小部分跑琼脂糖电泳了解RNA提取的质量，用普通琼脂糖能跑出这样的效果，只是需要特别注意:
1. 可以用TAE缓冲液，不必用TBE，但一定要新鲜配制；
2. 电泳槽不必用DEPC处理，可以先用75％乙醇处理，再用3％H2O2浸泡30分钟即可；
3. 你说的RNA降解确有其事，告诉一个方法：短时间内采用高电压180V左右跑30分钟，效果一样好。
4. 一般提取RNA后，28、18S较亮当然是好事，但我想很多人的重点不在rRNA上，而是在mRNA上，总体mRNA表达量怎样主要看围绕28、18S比较模糊的
smear 条带，特别是在做了诱导表达后就特别明显。

材料量太大时，容易产生dna污染。建议降低材料量的比例，如用trizol，要基本保证100mg加1ml，离心力要在12000g。

分离到淋巴细胞后最好加入TRIZOL，然后-20度，最好是-70度冻存，要不然RNA会降解，因为TRIZOL试剂内含有抑制RNA降解的成分，我也曾经将淋巴细胞冻存，过两周后去提发现降解好厉害，而加入TRIZOL后要好很多，可以保存6个月左右；一般TRIZOL都是加1ml，枪头和EP管最好用DEPC处理，但是一次性使用的话，根据我们的经验，高压一下就可以，当然前者更为保险；

trizol的量是根据细胞的量来的，一般1ml对应5*10e6的细胞，细胞太多效果反而不好，会有蛋白和DNA的污染。试剂盒的效果不一定比trizol好，因为很多的原理都跟trizol差不多，不过由于一般都还采用硅胶吸附的过程，产量稍高一点。如果用进口试剂盒的话，qiagen是首选；ambion是专门做RNA的，应该也很强，不过没用过；invitrogen也可以考虑。不管用什么试剂，整个操作过程中都要避免RNA酶的污染。DEPC怎么都要准备一点。

RNA的定量与纯度：
RNA通常用分光光度计定量，测量在260nm处的吸收值（A260）。通常分光光度计A260的读数要介于0.15-1.0之间才是可靠的，因此RNA提取结束后，要根据大概产量稀释（推荐用10 mMTris.HCl, pH 7.0稀释）到适当浓度范围，再用分光光度计测量。A260为1相当于RNA的浓度为40?g/ml。

　　为了检测RNA的纯度，可以测量A260与A280的比值，通常纯RNA的A260/A280为1.9-2.1。

OD260 OD280 OD230

1. 260、320、230、280nm下的吸光度分别代表了核酸、背景（溶液浑浊度）、盐浓度和蛋白等有机物的值。

2. 在提取RNA时，一般来说我们只看OD260/OD280（Ratio，R）。当R>1.82时，说明RNA中蛋白或者其他有机物的污染是可以容忍的，不过要注意，当用Tris作为缓冲液检测吸光度时，R值可能会大于2（但一般应该是<2.2的）。当R<1.8时，溶液中蛋白或者时其他有机物的污染比较明显，你可以根据自己的需要决定要不要使用这份RNA（不同的实验对RNA质量的要求不同）。当R>2.2时，说明RNA已经水解成单核苷酸了。

3. 这里说到的OD260/OD230的比值可以主要用于说明在提取后的RNA样品中是否还混有异硫氰酸胍等盐类物质，也可以说在用Trizol法提取RNA后看看其纯度如何？OD230过高说明里面盐离子浓度太高,可以用氯仿再抽提蛋白,沉淀用70%乙醇多洗涤两次即可改善OD230。A260/A230比值应大于2.0,如果远小于这个值,则表明其中有大量的小分子或盐存在.



提过程中使用的许多试剂影响 A260 和A280 读数；同时，对同一样品 10 倍数量级稀释后测定吸光值发现，分光光度计的吸光值仅在一定的区域是线性的。结论是：当A260 读数处在 0.1-0.5 之间，A200到 A320 之间的数值构成一条光滑的曲线时，A260/A280比值是衡量核酸纯度的标准之一。
少量苯酚 (30 ul/ml) 残留使A230，A260，A280均变大 (差不多增加一倍)，但A260/A280 和A260/A230 均在 2 左右。少量异硫氰酸胍(132 uM) 残留使 A230 变大，但A260，A280 几乎不变，所以A260/A280 仍在 2 左右，而A260/A230 大大小于 2。大量异硫氰酸胍(2.4 M) 残留使A230，A260，A280均变大，根本就没有办法测定了。PEG (6.25%) 残留使A230，A260，A280均变大，但对 A230，A260影响更大，所以 A260/A280 比2 大不少，而A260/A230 仍在 2 左右。

A230 测定其它碳源物质，如酚，糖类等，A260是核酸的吸收峰测 RNA 和DNA，引物等的浓度用的， A280 是蛋白质的吸收峰。A260/A280是检测核酸中有没有蛋白质污染，A230/A260是检测核酸中有没有把酚去除干净，另外用TRIZOL 抽提RNA时不能把糖类去除干净的，所以有时候也有必要测一下A230/A260的比值。
Nucleic Acid Determination
The absorption of 1 OD (A) is equivalent to,approximately: 50 ug/ml dsDNA, 37 ug/ml ssDNA, 40 ug/ml RNA or 30 ug/ml foroligonucleotides. The ratio A260/A280 is used to estimate the purity of nucleicacid, since proteins absorb at 280 nm. Pure DNA should have a ratio ofapproximately 1.8; pure RNA 2.0. Absorption at 230 nm reflects contamination ofthe sample by substances such as peptides, phenols, aromatic compounds orcarbohydrates. In pure samples the ratio of A260/A230 should be approximately2.2.

RNA 操作注意事项与实验技巧
操作注意事项：
　　由于RNA酶的广泛存在与难以灭活的顽固特性。使得RNA的提取纯化和后续工作变得非常困难。为了保证RNA的研究工作成功，请仔细阅读下列注意事项，相信它能帮助您解
决常见的问题。

　　归根究底，RNA工作的主要问题是防止RNA酶的污染。RNA酶无处不在，在实验操作的任何一步，任何偶然的疏忽或不当操作都有可能造成RNA酶污染，从而导致整个实验失败。因此，严格控制实验条件，避免任何可能的污染是保证实验成功的关键，必须做到以下几点：

1.如果可能，实验室应辟出专门RNA操作区，离心机、移液枪、试剂等均应专用。RNA操作区应保持清洁，并定期进行消毒。

2.操作过程中应自始至终佩戴抛弃式橡胶或乳胶手套，并经常更换，以避免将手、臂上的细菌和真菌以及人体自身分泌的RNA酶带入试管或污染用具。尽量避免使用抛弃式塑料手套。塑料手套不贴身，常常造成操作不便，而且多出部分还容易在器具上遭RNA酶污染并向未污染处传递，扩大污染。

3.尽量使用一次性枪头、离心管等塑料制品，尽量避免与其它实验共享器具，以防止交叉污染。推荐使用出厂前已经灭菌的枪头和离心管，大多国外厂商供应的无菌塑料制品很少有RNA酶污染，买来后可直接用于RNA操作。许多研究者用DEPC等处理的塑料制品，往往由于二次污染而带有RNA酶，从而导致实验失败。

4.配制溶液用的酒精，异丙醇、Tris等应采用未开封的新品。溶液需用DEPC水配制（加0.01%(体积比)DEPC至重蒸水或Mili Q级水中，处理过夜，灭菌即成DEPC水）。

5.所有玻璃制品都必须在240℃烘烤4小时。所有旧塑料制品都必须用0.5M的NaOH处理10分钟，并用DEPC-H2O彻底冲洗后灭菌，也可考虑用0.01%的DEPC水浸泡过夜，然后灭菌，烘干。无法用DEPC处理的用具可以用氯仿擦拭若干次，这样通常可以消除RNA酶的活性。

样本保存的注意事项：
　　样本一旦从生物体中分离后，细胞内的RNA就变得非常不稳定，容易降解。因此取样后，如何保证取样前后基因的表达模式不变，就变得非常重要。传统方法是用液氮速冻，再放到超低温冰箱中保存。

　　目前有些厂家开发出专门的RNA保护剂，如Qiagen公司的RNAlater是具有抑制RNase和稳定RNA作用的试剂，将采集的组织样本等直接放入到RNAlater中，即可起到稳定样本中RNA的作用。无需液氮或干冰，方便安全地在室温下保存一段时间，低温可长期保存。还有对细菌样本专用的RNAprotect Bacteria Reagent及对血液样本专用的PAXgene? Blood RNA System。

OMEGA BIOTEK

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