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2017-10-14 06:22
一).构建cDNA文库：
以生物细胞的总 mRNA 为模板，用反转录酶合成互补的双链 cDNA ，然后接到载体上，转入到宿主后建立的基因文库就是 cDNA 文库。 1、mRNA的提取及其完整性的确定 1） 总 RNA 的提取 RNA 提取方法：APGC法或NP-40或应用试剂盒提取总RNA 2）mRNA的分离 高等真核生物 mRNA 分子的 3' 端均有 poly(A) 尾，将总RNA通过寡聚（DT）纤维柱分离mRNA或利用磁珠法制备纯mRNA。在某些情况下，裂解细胞后用蔗糖梯度来制备mRNA-核糖体复合物作为提取mRNA的替换途径。 3） mRNA 的纯化 ①按照大小对总 mRNA 进行分级，主要用琼脂糖凝胶电泳和蔗糖密度梯度离心法进行分级；②多聚核糖体的免疫学纯化法，这是利用抗体来纯化合成目的多肽的方法。 4）mRNA 完整性的确定 确定 mRNA 完整性的方法有三种： ① 直接检测 mRNA 分子的大小； ② 测定 mRNA 的转译能力； ③ 检测总 mRNA 指导合成 cDNA 第一链长分子的能力。 2、 cDNA 的合成和克隆 1） cDNA 第一链的合成 用亲和层析法得到 mRNA 后，根据 mRNA 分子的 3' 端有 poly (A) 尾结构的原理，用 12~20 个核苷酸长的 oligo （ dT ）与纯化的 mRNA 混合， oligo （ dT ）会与 poly (A) 结合作为反转录酶的引物，反转录反应的产物是一条 RNA-DNA 的杂交链。 oligo （ dT ）结合在 mRNA 的 3' 端，因此合成全长的 cDNA 需要反转录酶从 mRNA 分子的一端移动到另一端，有时这种全合成难以达到，尤其是 mRNA 链很长时，为此建立了一种随机引物法合成 cDNA 。随机引物是一种长度为 6~10 个核苷酸，由 4 种碱基随机组成的 DNA 片段。与 oligo （ dT ）仅与 mRNA 3' 端结合不同，它们可以在 mRNA 的不同位点结合。随机引物法合成的产物也是 RNA-DNA 的杂交体。把 cDNA 克隆到载体中之前，必须把这种杂交体中的 RNA 转变成 DNA 链，即形成双链 DNA 分子。 2）. 双链 cDNA 的合成 合成 cDNA 第二条链有两种方法。一种方法是利用 cDNA 第一链的 3' 末端常常出现发夹环的特征，这种发夹结构是反转录酶在第一链末端“返折”并且进行复制第一链的结果，它为合成 cDNA 第二链提供了有用的引物。用这种方法合成的双链 cDNA 在一端有一个发夹环，可以用单链特异的 S1 核酸酶切去。但是 S1 核酸酶的处理，常常会“修剪 ” 过多的 cDNA 顺序，使 cDNA 丢失了 mRNA 5' 端的部分顺序。 另一种方法是用大肠杆菌的 RNase H 进行修饰。 RNase H 能识别 RNA-DNA 杂交分子并把其中的 RNA 切割成短的片段，这些 RNA 短片段仍与 cDNA 第一链结合，可被新合成的 DNA 所取代。新合成的 DNA 存在切口，用 DNA 连接酶把这些切口连接在一起形成一条完整的 DNA 链。 RNase H 法优于 S1 核酸酶法，它能获得包括 mRNA 5' 端全部或绝大部分的更长顺序 cDNA 分子。 3） 将 cDNA 重组到载体上 合成的 cDNA 与载体 DNA 进行连接一般有 3 种方法： ① 借助于末端转移酶的 3' -OH 端合成均聚物的能力，双链 cDNA 和线性化载体 DNA 的 3' -OH 端分别加上均聚核苷酸链； ② 双链 cDNA 和线性化载体 DNA 分别用 Klenow 片段进行末端补平，然后用 T4 DNA 连接酶进行齐头连接，形成重组体； ③ 通过粘性末端连接。 4）. 转化 重组的载体 DNA 分子在一定条件下转化入大肠杆菌，形成携带质粒的菌株。当不同重组的 DNA 含有不同的 cDNA 基因时，整个转化子含有来自 mRNA 群体的各种 cDNA 基因，这样的转 化子群体构成该 mRNA 全部遗传信息的 cDNA 基因文库。 5）. 目的 cDNA 克隆的鉴定 用于从 cDNA 文库中筛选和鉴定目的 cDNA 的方法主要有 3 种： ① 核酸杂交 ② 免疫学杂交检测 ③ cDNA 同胞选择 |
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