【求助】急急急，关于载体构建，酶切条带显示已插入正确片段，但...

【求助】急急急，关于载体构建，酶切条带显示已插入正确片段，但测序结果是错误的

忘了说，我的片段是1752bp的

在线等，有没有大神能给我出出主意？

首先。。。。你这个启动子的序列是从什么地方来的，是基因组吗？有的时候基因组的数据。。。或者说你用的这个菌或者细胞的数据和NCBI上面是不一样的。假设你是质粒上的，那么肯定是你P错啦，用一个好一点的酶来P,phusion够厉害啦，就可以了。双酶切切不开，可能是杂菌，我有的时候也会碰到。最后，你用thermo的酶都切不开。。。。用takara的怎么会可以呢。。。。

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HR微生物
首先。。。。你这个启动子的序列是从什么地方来的，是基因组吗？有的时候基因组的数据。。。或者说你用的这个菌或者细胞的数据和NCBI上面是不一样的。假设你是质粒上的，那么肯定是你P错啦，用一个好一点的酶来P,phusion够厉害啦，就可以了。双酶切切不开，可能是杂菌，我有的时候也会碰到。最后，你用thermo的酶都切不开。。。。用takara的怎么会可以呢。。。。

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这个启动子序列是基因组的，用的菌是DH5a，pcr用的模板也是基因组。但是连pgem-teasy后双酶切切开了啊。。

DH5a是吧，那么一般都是准确的。你做错的地方假如不是太关键，比如说。。。。-10区什么的，翻译起始点啊。。。其实都可以用的啦，影响不大，关键是你突变了多少个点以及在什么位置，假如你真的想弄好，就重新用好一点的酶来弄，假如结果是一样的，那么说明你的基因组就是这样，你做对的，他们测错了。然后克隆转化有的时候就会遇到各种诡异的情况，比如说切不开，我觉得，你忽略她，继续往下做就好。。。我的意思是重新做一遍，挑一遍就好，注意不要染了和你实验室差不多的杂质粒。或者你切不开，想知道，可以用通用引物去测试一下，看看为什么会这样。

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HR微生物
DH5a是吧，那么一般都是准确的。你做错的地方假如不是太关键，比如说。。。。-10区什么的，翻译起始点啊。。。其实都可以用的啦，影响不大，关键是你突变了多少个点以及在什么位置，假如你真的想弄好，就重新用好一点的酶来弄，假如结果是一样的，那么说明你的基因组就是这样，你做对的，他们测错了。然后克隆转化有的时候就会遇到各种诡异的情况，比如说切不开，我觉得，你忽略她，继续往下做就好。。。我的意思是重新做一遍，挑一遍就好，注意不要染了和你实验室差不多的杂质粒。或者你切不开，想知道，可以用通用引物去测试一下，看看为什么会这样。

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连上pgem-teasy载体后测序显示两端引物正确的，中间全错。。。。。 而且送了两家公司测序，测序结果不一样的，但都和预期不一样。。。。纠结了

那么污染了什么序列呢，假如是污染，你的胶回收就要注意操作了，各种换实验试剂。要不就换柱子回收来做，你这样得闲现象我也碰到过，最好的方法就是重做，换试剂，没有其它更好的了。要么，你就先P一个更加长的，就是你的启动子的上下游，先做一个TA，接着再在上面亚克隆。