百万火急，重组质粒酶切只有一条带，测序显示目的基因已连在载体...

Is the construct maxiprep sequenced? If it is, have you tried sequencing using primers the nucleotide sequence of which is derived from the insert DNA?

试过的，分别涉及两对引物，一对在插入的目的基因上，一对在载体上，做质粒PCR都可以P的出目的条带，但是再做双酶切，都只有一条带。

Can you find the two enzyme sites in the sequence data?

会不会是其中一个酶切位点发生了突变或者甲基化导致切不下来?

重新连接后的目的序列，经测序分析，双酶切位点都还在的。谢谢各位，已找到原因。