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同源臂引物设计...

已解决 悬赏分:0 - 解决时间 2024-11-24 16:37
同源臂引物设计
举报 2017-07-31 05:25
你是用red呢?还是crispr呢
举报 2017-08-02 18:41
dxy_87tjxc76
你是用red呢?还是crispr呢

你说的red crispr是基因重建和基因编辑一类的吗?之前没接触过,我用的是knock out,是基因打靶一类的,谢谢
举报 2017-08-01 12:00
谢小丫1V0C

你说的red crispr是基因重建和基因编辑一类的吗?之前没接触过,我用的是knock out,是基因打靶一类的,谢谢

基因敲除的方法有很多种的,目前较新的是crispr,另外,你是敲真核呢?还是原核?
举报 2017-07-30 09:00
谢小丫1V0C

你说的red crispr是基因重建和基因编辑一类的吗?之前没接触过,我用的是knock out,是基因打靶一类的,谢谢

还有你具体用的什么方法…你得说清楚啊
举报 2017-08-08 01:41
dxy_87tjxc76

还有你具体用的什么方法…你得说清楚啊

我敲除的是结核分枝杆菌,用的是SOE-PCR。用的是卡那霉素替代该敲除基因。大概是先扩增出该引物的上下两段同源臂和卡那霉素,然后用SOE-PCR把它们融合在一起然后转到质粒里。我先从GenBank下载该基因序列,然后设计出该基因的上下游引物,但是关于上下游同源臂的引物不知道怎么设计,谢谢你告知!
举报 2017-08-05 02:13
嗯,你这个敲除的原理也是同源重组吗?
举报 2017-08-01 22:00
dxy_87tjxc76
嗯,你这个敲除的原理也是同源重组吗?

嗯嗯,是的
举报 2017-08-02 01:44
谢小丫1V0C

嗯嗯,是的

大概懂你的意思了,你的意思是,首先分别通过PCR获得需要敲除基因两端的同源臂和卡纳抗性基因,然后通过OVER LAP PCR将这三个连起来,然后是通过同源重组把这三个连到质粒上?再通过电转转入目的菌株进行同源重组敲除,但是你的菌株本身表达重组酶吗?还是说文献中报道的这个菌株的敲除方法就是这样的,还是有些地方没有明白,OVER LAP PCR的话主要是在设计引物的时候加入同源臂吧?

举报 2017-08-02 08:58

展开引用

dxy_87tjxc76

大概懂你的意思了,你的意思是,首先分别通过PCR获得需要敲除基因两端的同源臂和卡纳抗性基因,然后通过OVER LAP PCR将这三个连起来,然后是通过同源重组把这三个连到质粒上?再通过电转转入目的菌株进行同源重组敲除,但是你的菌株本身表达重组酶吗?还是说文献中报道的这个菌株的敲除方法就是这样的,还是有些地方没有明白,OVER LAP PCR的话主要是在设计引物的时候加入同源臂吧?

......


嗯嗯,这个主要是设计引物,引物很重要,上下游同源臂P出来,把替代目的基因的序列P出来,把三者融合,然后连到质粒上
举报 2017-08-08 20:49
谢小丫1V0C

嗯嗯,这个主要是设计引物,引物很重要,上下游同源臂P出来,把替代目的基因的序列P出来,把三者融合,然后连到质粒上

没做过over lap,我先前试过同源重组的方法进行连接的,也是两个同源臂连到质粒上,通过同源重组将同源臂连起来,并且连在质粒上,你感兴趣的话可以去搜下同源重组连接的方法
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