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收藏  |   举报 2017-07-29 22:04   关注：285   回答：12

同源臂引物设计...

已解决 悬赏分：0 - 解决时间 2024-11-14 17:56
同源臂引物设计
举报 2017-07-31 05:25
你是用red呢？还是crispr呢
举报 2017-08-02 18:41
dxy_87tjxc76
你是用red呢？还是crispr呢

你说的red crispr是基因重建和基因编辑一类的吗？之前没接触过，我用的是knock out，是基因打靶一类的，谢谢
举报 2017-08-01 12:00
谢小丫1V0C

你说的red crispr是基因重建和基因编辑一类的吗？之前没接触过，我用的是knock out，是基因打靶一类的，谢谢

基因敲除的方法有很多种的，目前较新的是crispr，另外，你是敲真核呢？还是原核？
举报 2017-07-30 09:00
谢小丫1V0C

你说的red crispr是基因重建和基因编辑一类的吗？之前没接触过，我用的是knock out，是基因打靶一类的，谢谢

还有你具体用的什么方法…你得说清楚啊
举报 2017-08-08 01:41
dxy_87tjxc76

还有你具体用的什么方法…你得说清楚啊

我敲除的是结核分枝杆菌，用的是SOE-PCR。用的是卡那霉素替代该敲除基因。大概是先扩增出该引物的上下两段同源臂和卡那霉素，然后用SOE-PCR把它们融合在一起然后转到质粒里。我先从GenBank下载该基因序列，然后设计出该基因的上下游引物，但是关于上下游同源臂的引物不知道怎么设计，谢谢你告知！
举报 2017-08-05 02:13
嗯，你这个敲除的原理也是同源重组吗？
举报 2017-08-01 22:00
dxy_87tjxc76
嗯，你这个敲除的原理也是同源重组吗？

嗯嗯，是的
举报 2017-08-02 01:44
谢小丫1V0C

嗯嗯，是的

大概懂你的意思了，你的意思是，首先分别通过PCR获得需要敲除基因两端的同源臂和卡纳抗性基因，然后通过OVER LAP PCR将这三个连起来，然后是通过同源重组把这三个连到质粒上？再通过电转转入目的菌株进行同源重组敲除，但是你的菌株本身表达重组酶吗？还是说文献中报道的这个菌株的敲除方法就是这样的，还是有些地方没有明白，OVER LAP PCR的话主要是在设计引物的时候加入同源臂吧？
举报 2017-08-02 08:58

展开引用

dxy_87tjxc76

大概懂你的意思了，你的意思是，首先分别通过PCR获得需要敲除基因两端的同源臂和卡纳抗性基因，然后通过OVER LAP PCR将这三个连起来，然后是通过同源重组把这三个连到质粒上？再通过电转转入目的菌株进行同源重组敲除，但是你的菌株本身表达重组酶吗？还是说文献中报道的这个菌株的敲除方法就是这样的，还是有些地方没有明白，OVER LAP PCR的话主要是在设计引物的时候加入同源臂吧？

......


嗯嗯，这个主要是设计引物，引物很重要，上下游同源臂P出来，把替代目的基因的序列P出来，把三者融合，然后连到质粒上
举报 2017-08-08 20:49
谢小丫1V0C

嗯嗯，这个主要是设计引物，引物很重要，上下游同源臂P出来，把替代目的基因的序列P出来，把三者融合，然后连到质粒上

没做过over lap，我先前试过同源重组的方法进行连接的，也是两个同源臂连到质粒上，通过同源重组将同源臂连起来，并且连在质粒上，你感兴趣的话可以去搜下同源重组连接的方法
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