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2018-02-02 22:31
用镍柱镍柱分离纯化
固定金属离子亲和柱主要用于金属螯化离子。位于许多蛋白中的组氨酸残基将会和许多金属离子，例如锌。铜，镍，铁等形成复合物。因此，该柱料能选择性螯合一些具有组氨酸残基的蛋白质。但是半胱氨酸和咯氨酸残基也能和固定化金属螯和。但是亲和力比组氨酸要弱。所以，结合的强度是和缓冲液的PH和金属离子决定的。 金属螯和柱料主要是由亚氨基的乙酰乙酸成分耦联琼脂糖柱料，借助醚长生7个原子的空间。 全部容量：24-30um的含有zn的干胶 柱料结构：6%的高铰链的琼脂糖 柱料大小：45-165um 平均微粒：90um 直流速度：25度/0.1MPa/30倍柱床/5厘米高度/每小时可达700厘米 最大压强：0.3MPa PH变化：长期3-13 短期2-14 化学稳定：通用含水缓冲液 0.01M盐酸，1.0M NAOH,20%乙醇（保存7天） 物理性质：可以忽略在PH或者离子变化下的体积变化 耐热性能：121度下0.1M乙酸钠作用半小时 金属螯和柱料保存于事先填充于20%乙醇。所以要搅拌驱除20%乙醇溶液。换成去离子水。比例是25%去离子水和75%处理胶。 处理金属螯和柱料： 1 平衡所有用到的材料于室温。 2 搅拌金属螯和柱料 3 倒水进柱子，驱除气体。用无离子水液封几厘米。 4 将金属螯和柱料连续倒进柱子，用玻璃棒支撑柱壁防止气泡形成。 5 然后立即用无离子水液封，装上柱盖，连接上泵。 6 打开柱子底部的开关，然后调节泵的流速。通常是不超过0.3MPa的。 7 经过一个稳定的柱床填鸭后，维持填压速度为3个柱床。 使用adaptor 1 经过上溯填鸭后，关闭柱床下面开关，移开上面的薄膜，小心的加上去离子水进行液封。 2 一定角度插入adaptor，确保没有气泡。 3 确保所有的连接都没有问题，柱子/泵/样品接受器 4 倾斜插入活塞确保没有气泡和管道充满液体。利用活泵正反向的流动确保没有气泡。 5 固定adaptor，打开柱子开关，开始缓冲液的流动。先以填鸭的速度直到柱床稳定后。 固定金属离子： 金属螯和柱料通过水来螯和金属的，避免发生沉淀在胶上。 1 确保柱子已经平衡好。如果有必要可以洗2个柱床（去离子水） 2 选择金属离子和0.1-0.3M中弱性酸。例如铁离子PH 3左右就好，避免形成沉淀和共沉。 3 加入一倍柱床的金属离子溶液 45倍柱床的去离子水洗涤 5至少2倍柱床的平衡缓冲液 结合： 发生于PH5.5-8.5之间.最强反映发生于最后 初始缓冲液的选择决定于金属离子和样品的结合性质。乙酸钠或者磷酸钠是比较好的缓冲液中不能使用EDTA或者柠檬酸盐 最通用缓冲液： 0.01-0.2M磷酸钠 0.05M乙酸钠 强烈推荐加入0.15-0.5M NaCl用于防止离子交换。 通常如果不知道一个蛋白的结合能力，最好的就是使用锌离子和中性的磷酸或者乙酸盐，同时含有0.15-0.5M NaCl 去垢剂不会影响蛋白质的结合能力 金属离子的取代意味着蛋白发生了结合。这种现象可以通过颜色来决定 洗脱蛋白：（3种方法） 1 降低PH(一步或者分步)，大部分蛋白溶解于PH4-6最终3-4是可容的。可选择柠檬酸盐，磷酸或者乙酸盐。 2 逐步提高咪唑的浓度（0-0.5M），梯度变化最好是在初始缓冲液的PH范围。 3 加入EDTA或者EGTA可洗脱蛋白质。但是不是通用的。 利用离心或者重力作用纯化组氨酸位点蛋白 通过上镍进行选择性结合含有组氨酸位点蛋白，然后利用含有咪唑的缓冲液洗脱蛋白。 以下的实验是为了最大化将组氨酸位点蛋白结合到金属螯和柱料，然后确保能够洗脱下来。当结合和洗脱的条件尚未明了时，这些方法也是很好用的。 为了获得高纯度的蛋白，必须摸索咪唑的缓冲液在样品上柱和洗脱时的浓度。通常使用10mM-500mM范围的咪唑的缓冲液进行剃度洗脱，然后通过收集和SDS-PAGE 蛋白电泳确定洗脱浓度。 为了纯化不可容的含有his位点的蛋白质，（包含体），可以在变性条件下进行。利用8M尿素或者6M盐酸呱进行溶解蛋白。 样品处理： 样品要经可能溶解，避免出现堵塞现象，所以可以利用0.45uM虑膜过滤杂志 如果样品时溶解于20mM磷酸缓冲液中（含有0.5M Nacl,PH7.4），必须调整PH到7－8。 上柱前准备： 洗柱料： 1 亲柔震动胶瓶充旋胶料 2 利用吸管吸出足量柱料用以纯化目的。每毫升柱料可以吸纳5毫克蛋白 3 500g 离心2－5分钟，沉淀柱料。 4 小心去除上清 5 加入5倍体积去离子水，充分振荡柱料。可以倒置来回5分钟，不要机械搅拌。 6 再次500g 离心2－5分钟，沉淀柱料。 7 再次小心去除上清 挂镍： 1 加入0.5倍柱床体积0.1M硫酸镍，充分振荡柱料。可以倒置来回5分钟，不要机械搅拌。 2500g 离心2－5分钟，沉淀柱料。 3小心去除上清 洗柱： 1加入5倍体积去离子水，充分振荡柱料，来回倒置5分钟 2500g 离心2－5分钟，沉淀柱料。 3小心去除上清 4 再洗两次柱料（一共3×5柱床去离子水） 5 最后用一倍体积起始缓冲液充旋柱料（20mM Na2HPO4 /0.5MnaCl/10mM咪唑/PH7.4） 利用离心来纯化： 上样： 1 在起始缓冲液中加入样品，然后使整体胶浓度达到50％ 2 亲柔搅拌，室温离心5－30分钟，结合能力取决于蛋白和样品浓度。 3 500g 离心2－5分钟，沉淀柱料。 4 取出上清。部分用于SDS-PAGE 蛋白电泳 洗胶： 1 加入5倍体积起始缓冲液，搅拌5分钟 2 500g 离心2－5分钟，沉淀柱料。 3取出上清。部分用于SDS-PAGE 蛋白电泳 4再洗两次柱料（一共3×5柱床起始缓冲液）。记得取出上清，部分用于SDS-PAGE 蛋白 电泳 洗柱： 1 加入2倍体积洗脱缓冲液（20mM Na2HPO4 /0.5MnaCl/10mM咪唑/PH7.4）搅拌5分钟 2再次500g 离心2－5分钟，沉淀柱料。 3再洗四次柱料（一共5×2柱床洗脱缓冲液）。记得取出上清，部分用于SDS-PAGE 蛋白电泳，280nM吸光值，ELISA,WESTERN 利用流速和重力纯化： 1 在柱子底部加上滤器 2 加水排气 3 加柱帽，去除残余水。推荐是最多2 Ml柱料就可以了 样品结合： 1 倒胶进入柱子 2 小心上样，用波棒室温搅拌5－30分钟 3 打开柱帽，收集流出峰用于分析 洗胶： 1 加入5倍体积起始缓冲液，收集流出液用于SDS-PAGE 蛋白电泳 2再洗两次柱料（一共3×5柱床起始缓冲液）。记得取出上清，部分用于SDS-PAGE 蛋白 电泳 洗柱： 1 加上柱帽，加入2倍体积洗脱缓冲液（20mM Na2HPO4 /0.5MnaCl/10mM咪唑/PH7.4）搅拌5分钟。打开柱帽，收集流出峰 2再洗四次柱料（一共5×2柱床洗脱缓冲液）。记得取出上清，部分用于SDS-PAGE 蛋白电泳，280nM吸光值，ELISA,WESTERN 注意：0.5M咪唑的280nM吸光值＝0.5 常见问题： 1 样品太粘稠 答：核酸存在影响，可以继续超声，加入RNA酶至10ug/mlDNA酶至5ug/ml。然后冰浴1 0－15分钟。或者也可以用注射器来回充旋。这样可以防止堵塞柱料。 2 平衡时样品洗脱了下来 答: 检查PH和缓冲液成分，如果缓冲液成分不正确，EDTA加入，强还原剂加入，都会导致这个现象出现。 加大胶的量，如果胶料承载能力过头，也绘出出现这现象。 准备新鲜的柱料，如果柱料断裂，也挂不上蛋白。 3 在洗脱液中不含有组氨酸蛋白 答：如果SDS-PAGE 蛋白电泳已经发现蛋白存在于超声液中 超声可能不完全。可以用显微镜观察超声情况。AD260/280比值。（通常是超声前将10mg/ml溶菌酶加入25mM Tris-HCL，PH6-8），避免发泡以降解融合蛋白。 蛋白可能是是包含体，可以使用4－6M盐酸呱或者4－8 M尿素溶解。 尿素溶解的可以进行SDS-PAGE 蛋白电泳，盐酸呱溶解的不可以进行SDS-PAGE 蛋白电泳，必须换缓冲液。 洗脱液浓度太稀，可以加大咪唑浓度或者降低PH 来决定最佳洗脱条件如果在平衡前的洗柱发现了目的蛋白，证明起始缓冲液中的咪唑浓度太高，可适当降低。 4 考马氏亮蓝或者银染发现多条带 答：加入蛋白激酶抑制剂。可能是蛋白降解。用凝血酶切割前必须去除丝氨酸蛋白酶抑制剂采用梯度咪唑来洗脱蛋白。在平衡洗脱液中加入10mM咪唑可以洗脱大量杂质而不会洗脱融合蛋白。低于500mM咪唑可以洗掉绝大部分杂质。 在洗脱步奏往起始缓冲液加入去垢剂（2％TRITON x-100或者2％Tween20）50% 葡萄糖，20mM B-巯基乙醇。记得杂质通常没有特意结合能力，可以改变缓冲液来洗脱。 如果杂志和目的蛋白有相同结合能力，那就不能用于纯化。因此可以使用别的纯化系统，例如含有GST尾巴就用谷胱甘肽琼脂糖4B 柱料再生，清洁和保存 柱料再生： 1 使用0.05M EDTA,0.5M NaCl来洗脱镍离子。然后用3柱床的0.5M NaCl来洗干净EDTA 2如果是铁离子可以用0.05M EDTA泡过夜 3 这一步可以洗脱上面未能洗脱的残余结合蛋白 清洗柱料： 1 0.5倍柱床2M NaCl，反向洗脱10－15分钟 2 1M NaOH洗1小时去除残余蛋白 3 每一步都要用3倍柱床起始缓冲液清洗 4 4倍柱床70%乙醇洗脱强亲水蛋白和脂类蛋白。 也可以使用2倍柱床去垢剂。0.1-0.5%非离子去垢剂溶于0.1M乙酸。浸泡1－2小时。最后用5个柱床的70％乙醇去除去垢剂。 清洁： 1 尽可能去除微生物 2 0.5-1M NaOH反向流动半小时 3 再用3－5倍柱床消毒的起始缓冲液平衡 4 这个清洁步奏不一定能够提高纯化能力 保存： 长期保存于20％乙醇或者0.01M NaOH 于4度 |
已解决
