紧急求教实时荧光定量PCR...

紧急求教实时荧光定量PCR

扩增目标基因，纯化后，用分光光度计，定浓度后做为标准品。最好是将此目标基因接入TA克隆，转导入大肠杆菌后扩增，抽质粒，可达1X10十二次方，再以每10倍稀释后作为标准品，一般从1X10八次方开始稀释。标准品一般选六个点，起跳的Ct值最好在20-30之间。另外，标准品及样品要同时重复做2-3管，标准曲线的R值在0.98以上，每10倍稀释的标准品Ct值一般相差3.3左右。

我现在在做，两个系统，sybrgreen和taqman。
我是用质粒DNA做标准曲线，（测OD，计算copy数，按指数级稀释，从10的0次方到10的5次方，测ct，每次每个样本做两份，比较ct值，去掉可疑数据。这样做大概9次，作出曲线）。以后的样本测出的ct值上标准曲线，得出copy数。
我的感觉SYBRGREEN好用，但是不是特异性的。Taqprobe 虽然特异，但是比较麻烦。做标准曲线最好用质粒DNA，而不用PCR产物。
还有就是PCR的program，我用的SYBRGREEN是95度15分，94度15秒、60度30秒、72度30秒、40个循环。我试过很多基因，用这个程序结果都很好。

扩增目标基因，纯化后，用分光光度计，定浓度后做为标准品。最好是将此目标基因接入TA克隆，转导入大肠杆菌后扩增，抽质粒，可达1X10十二次方，再以每10倍稀释后作为标准品，一般从1X10八次方开始稀释。标准品一般选六个点，起跳的Ct值最好在20-30之间。另外，标准品及样品要同时重复做2-3管，标准曲线的R值在0.98以上，每10倍稀释的标准品Ct值一般相差3.3左右。