荧光PCR数据如何处理...

荧光PCR数据如何处理

扩增曲线机器上应该给出。
标准曲线是以模板拷贝数的对数值为X轴，CT值为Y轴得到的曲线(其实是直线)，一
般需要将模板稀释成不同指数级(4-6个)，这样就可以得到4-6个CT值，放入坐标系
就可以得到曲线，EXCEL就可以完成。

机器会在每个循环末读取每个WELL内的荧光量,然后对照参照荧光染料得到你所用的荧光染料的量去除基数就是每个循环得到的delta Rn值,以此为纵坐标,循环数为横坐标就是扩增曲线(Amplication Plot),这些机器的软件都会做,你只需在结束是从软件菜单中选择分析后显示就可,而且在你调整了基线和域值后就能得到每个标本的Ct值,然后你可以文本文件形式输出,而在EXCEL下一般能将此文本文件打开,然后你就能计算TRIPICATE的均数,标准差(可以知道你的加样误差).
当然你也可以直接输出RAW DATA,这是每个循环获得的Rn数值,你可以在EXCEL下打开这个文件,然后做散点图,和PCR软件做的扩增曲线比较相似,不过不大好看.
至于标准曲线,你只要将标准品按照比例依次稀释,如1:1,1:10,1:100,1:1000,1:10000,一般要求3个数量级,就是1到100,因为一般你测的基因差异不大会达到100倍的吧,然后获得每个稀释比例的Ct值,以此Ct值为纵坐标,标准品RNA量的LOG值为横坐标做出散点图,求的相关性直线方程,要求斜率在-3.32左右,这个数值一定是负值(道理你自己想一下吧),R的平方大于0.98,就可以啦.
文献参照ABI BULLETIN II