收藏 | 举报 2003-12-06 12:55 关注：261 回答：3

定量PCR求教...

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定量PCR求教

karenkerry

举报 2003-12-16 20:14

普通PCR结果毫不代表定量的也好。
你是荧光全定量PCR吗？
若是，那你的引物上要加上荧光素。
大连宝生物提供该技术。
但荧光素有好几种，要你自己根据引物选择。反正满复杂的，我当时很想做，查了很多书，也联系了大连宝生物经费不够，你准备10000元吧！

gxb111111

举报 2003-12-10 04:46

展开引用

xuef_qi
我是定量PCR的新手，有很多问题要请教大家。
我做的病毒的普通PCR结果还可以。我现在要做该病毒的定量。用的是ICycler定量PCR仪器。有那位高手能告诉我怎样操作该仪器。
我还要重新设计目的基因片段的因物吗？如果不用重新设计，那我下一步应该为做定量PCR做哪些准备呐？还需要设计参照模板吗？
这种实验的把握性有多大？
大家有什么更好的建议吗？

普通PCR结果还可以并不代表你的荧光PCR就可以开展，不知你的病毒是何种病毒？你用ICycler定量PCR仪器，你如果用Taqman技术，你必须设计引物和Taqman探针，不知你的ICycler定量PCR仪是否带有探针设计软件？如果绝对定量，你必须有定量标准品和内参照，本人经验，如果你是做课题，必须实验经费充足，仔细想想！Icycler的操作相对其它仪器复杂一些，你可以与我联系。但我感觉目前中国还没人做好绝对定量的，如果说有，那是骗人。

......

liumeng

举报 2003-12-08 04:45

首先你有多少经费，第二你什么时候毕业。如果经费充足时间不是太紧，可以试一下。

如果你选荧光染料，如sybr green，还不是太贵，但是这种方法特异性不好。如果你用TAQMAN系统，需要荧光探针，这个东东比较贵，好的探针一个就好几千。
你现在的产物多大，最好是在100-150左右，如果用SYBR GREEN，可以直接试一下你的引物。如果用TAQMAN，你还要看你的产物两个引物之间的区域还要能找到探针的结合区(也就是说这端序列能够满足探针设计要求)，如果不行，你就要重新设计引物了。
楼上的高手也说了，普通PCR好不一定定量PCR就好，即使你的引物能满足上面的条件，实际做起来，也会有问题。
引物和探针都有了，而且都没有问题，就要优化你的反应体系。然后用标准品如质粒DNA作标准曲线。
内参照一定要有，选好内参照后，同样的步骤从引物开始，直到作出标准曲线。
这样就可以作样本了。