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RNA PULL DOWN 探针制备服务

产品价格: ¥800.00

最小起订量:暂无 可售数量:999盒

发货时限:
暂无
所在地区:
中国江苏苏州市
有效期至:
长期有效
最后更新:
2021-06-01 01:30:02
浏览次数:
37
企业信息

产品详情

品牌名称:
提供商: Transheep,Shanghai
服务名称: 生物素标记RNA探针制备服务
lncRNA简介
长链非编码RNA(longnoncodingRNA,lncRNA)是一类不编码蛋白的RNA分子,长度在200bp以上;研究表明,lncRNA具有保守的二级结构,可以与蛋白、DNA和RNA相互作用,参与多种生物学过程的调控。随着高通量测序技术的发展,越来越多的lncRNA被注释,但是绝大多数的lncRNA的功能仍然不清楚,因此lncRNA的研究是一片非常广阔的未知领域,具有极大的科研价值和意义。其中RNAPull-down技术为lncRNA生物学功能的验证起到了至关重要的作用。

技术特点
  1. RNA 探针全链标记生物素,与末端标记的RNA探针相比亲和力更强。
  2. 配套的耗材与试剂,提供完整的RNA pull down 解决方案。
  3. 在线技术支持。
  4. 提供配套的LncRNA载体构建方案及整体实验解决方案,如lncRNA过表达、干扰,稳转细胞系构建、ceRNA、动物实验等相关技术指导。
实验流程
  1. 载体构建
  2. RNA探针制备
  3. 磁珠-RNA复合物孵育
  4. 蛋白提取
  5. RNA-Pro 孵育
  6. 洗脱
  7. 鉴定(SDS-PEGE银染,WB,MS)
 
  1. DNA模板构建
  1. 目的LNCRNA到T7启动子载体,如pcDNA3.1+
  2. 选择合适的限制性内切酶线性化质粒,获得线性化DNA模板,
  3. 使用DNA产物回收试剂盒胶回收目的片段,RNA体外转染需要高浓度高纯度的DNA模板,浓度不够可以乙醇沉淀或者冷冻干燥浓缩。
  1. RNA探针制备
使用T7体外转录试剂盒转录制备探针
普通RNA探针(对照用)
Transcription Buffer (5X) 10μl
NTP Mixture (10mM each) 10μl
线性DNA模板 1μg
Ribonuclease Inhibitor 50U
T7 RNA Polymerase 30U
补充经DEPC处理的去离子水 至50μl
    BIOTION RNA探针
Transcription Buffer (5X) 10μl
NTP Mixture (10mM each without CTP)
Bio-16-UTP(10mM)
10μl
线性DNA模板 1μg
Ribonuclease Inhibitor 50U
T7 RNA Polymerase 30U
补充经DEPC处理的去离子水 至50μl
   
 
  1. 反应:设置好反应体系后,轻轻混匀(可以用移液器吹打混匀或用 Vortex 在最低速度轻轻混匀),随后离心沉淀液体,孵育1~2 个小时。
  2. 消化:加入2ul DNase I 37ºC 孵育1小时,消化DNA模板。
  3. 终止:取出操作的EP管,加入2µl 0.2M  EDTA(pH=8.0)终止反应,然后将RNA 95℃加热2min,室温静置30min,加入Ribonuclease Inhibitor  2ul冰浴保存。
  4. 鉴定:电泳分析转录产物,或通过其他适当方法鉴定转录的效率。
 
  1. 磁珠-RNA 复合物孵育
  1. 处理:使用BSA和寡核苷酸随机引物封闭含链霉亲和素的磁珠。
  2. RIP Wash Buffer冲洗3次磁珠,然后将其加入到生物素标记并变性的RNA中,4℃过夜。
  3. 过夜的混合物磁珠分离1min,去上清。
  4. RIP Wash Buffer冲洗3次,切记将液体沿壁加入或者滴加,上下缓慢翻转混匀,切勿用移液器吹打。
 
  1. 蛋白裂解(核浆分离)
  1. 准备溶液:室温融解试剂盒中的三种试剂,溶解后立即放置在冰上,混匀。取适当量的细胞浆蛋白抽提试剂A备用,在使用前数分钟内加入PMSF,使PMSF的最终浓度为1mM。取适当量的细胞核蛋白抽提试剂备用,在使用前数分钟内加入PMSF,使PMSF的最终浓度为1mM。
    2.
     对于贴壁细胞:用PBS洗一遍,用细胞刮子刮下细胞,或用EDTA溶液处理细胞使细胞不再贴壁很紧,并用移液器吹打下细胞。离心收集细胞,尽最大努力吸尽上清,留下细胞沉淀备用。尽量避免用胰酶消化细胞,以免胰酶降解需抽提的目的蛋白。
    3.
     对于悬浮细胞:用PBS洗一遍,离心收集细胞,尽最大努力吸尽上清,留下细胞沉淀备用。
    4. 每20微升细胞沉淀加入200微升添加了PMSF的细胞浆蛋白抽提试剂A。(对于二百万HeLa细胞,其细胞沉淀的体积大约为20微升或40毫克。)
    5. 最高速剧烈Vortex 5秒,把细胞沉淀完全悬浮并分散开。(如果细胞沉淀没有完全悬浮并分散开,可以适当延长vortex时间。)
    6. 冰浴10-15分钟。
    7. 加入细胞浆蛋白抽提试剂B
     10微升。最高速剧烈Vortex 5秒,冰浴1分钟。
    8. 最高速剧烈Vortex 5秒,4℃ 12,000-16,000g离心5分钟。
    9. 立即吸取上清至一预冷的塑料管中,即为抽提得到的细胞浆蛋白。可以立即使用,也可以冻存。(千万不要触及沉淀,可以在沉淀上方保留极小体积的上清,以免触及沉淀。每200万细胞用200微升本产品中的细胞浆蛋白抽提试剂A裂解后可获得的上清,其细胞浆蛋白浓度约为2-5mg/ml,不同细胞有所不同。)
    10. 对于沉淀,完全吸尽残余的上清,加入50微升添加了PMSF的细胞核蛋白抽提试剂。(不吸尽上清会带来细胞浆蛋白的污染。)
    11. 最高速剧烈Vortex 15-30秒,把细胞沉淀完全悬浮并分散开。然后放回冰浴中,每隔1-2分钟再高速剧烈Vortex 15-30秒,共30分钟。
    12. 4℃ 12,000-16,000g离心10分钟。
    13. 立即吸取上清至一预冷的塑料管中,即为抽提得到的细胞核蛋白。可以立即使用,也可以-70℃冻存。每200万细胞用50微升本产品中的细胞核蛋白抽提试剂裂解后获得的上清,其细胞核蛋白浓度约为1.2-3.0mg/ml,不同细胞有所不同。
    14.
     对于新鲜组织:
    a. 把组织尽可能切成非常细小的碎片。按照20:1的比例混合适当量的细胞浆蛋白抽提试剂A和B(例如200微升细胞浆蛋白抽提试剂A中加入10微升抽提试剂B)。并加入PMSF至最终浓度为1mM配制成组织匀浆液。按照每60mg组织加入200微升组织匀浆液的比例混合组织和组织匀浆液(对于不超过30mg的组织样品,仅需加入100微升组织匀浆液),并在玻璃匀浆器内充分匀浆。匀浆需在冰浴或4℃进行。
    b. 匀浆后把匀浆液转移到塑料离心管内,冰浴放置15分钟。
    c. 4℃ 1,500g离心5分钟。把上清转移至一预冷的塑料管中,为抽提得到的部分细胞浆蛋白。(吸上清时千万不要触及沉淀。)
    d. 对于沉淀,到了这一步已经充分匀浆,但很多细胞还没有破碎。接下去按照使用说明的步骤4开始操作,即把沉淀当做已经离心收集好的细胞沉淀操作,按照步骤4至步骤13抽提得到细胞浆蛋白和细胞核蛋白(特别说明:对于起始量为30-60mg的组织样品,后续直接按照步骤4-13操作即可;对于起始量不超过30mg的组织样品,后续步骤4-13中的溶液的用量须减半使用)。抽提得到的细胞浆蛋白可以和步骤14c中抽提得到的细胞浆蛋白合并。新鲜的肝脏组织用本产品裂解后获得的上清,其细胞浆蛋白浓度约为3-10mg/ml,细胞核蛋白浓度约为3-10mg/ml,不同状态的不同组织有所不同。
 
  1. RNA-PRO复合物孵育
  1. 珠-RNA混合物中加入细胞裂解液,裂解液中加入适量RNase抑制剂,室温放置1h。
  2. 将孵育好的磁珠-RNA-蛋白混合物磁力离心,使用RIP Wash Buffer冲洗3次,1次1ml。
  3. SDS-PEGA  银染鉴定

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