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定点突变
宏基因组检测
[VIP第1年] 指数:1
EPB49-和元
NEU2-和元
RBM10-和元慢病毒包装
产品简介
慢病毒（Lentivirus）载体是以 HIV-1 （人类免疫缺陷1型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。具有感染谱广泛、可以有效感染分裂期和静止期细胞、长期稳定表达外源基因等优点，因此成为导入外源基因的有力工具。现在慢病毒系统已经被广泛应用到各种细胞系的基因过表达、RNA干扰、microRNA研究以及活体动物实验中。
科维创服务项目
上海科维创生物科技有限公司提供慢病毒载体构建、RNAi(shRNA)、miRNA、过表达和干扰慢病毒包装以及基于慢病毒技术的稳定细胞系构建服务。详情可查询： 病毒现货库
整体实验流程
（一） 实验流程（1、2、3为并列步骤）
1. 慢病毒过表达质粒载体的构建 设计上下游特异性扩增引物，同时引入酶切位点，采用PCR技术(采用高保真KOD酶，3K内突变率为0%)从模板中（cDNA质粒或者文库）调取目的基因CDS区（coding sequence）连入T载体。将CDS区从T载体上切下，装入慢病毒过表达质粒载体。
2. 慢病毒干扰质粒载体的构建 合成siRNA对应的DNA颈环结构，退火后连入慢病毒干扰质粒载体。
3. miRNA载体构建从 Genomic 中调取基因相应的Mir 前体, 并在调取引物中引入酶切位点。
4. 慢病毒载体的包装与浓缩纯化 制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒（两质粒包装系统），三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6 h 更换为完全培养基，培养48和72h后，分别收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，病毒上清液通过超离心浓缩病毒。
（二）流程图
提供产品
| 产品名称 | 病毒滴度 | 规格 | 赠送阴性对照病毒规格 |
| 过表达慢病毒 | ＞10^8 PFU/ml | 1ml | 1ml（＞10^8 PFU/ml ） |
| 干扰慢病毒 | ＞10^8 PFU/ml | 1ml | 1ml（＞10^8 PFU/ml） |
腺病毒包装
Ad5&Ad5/F35 腺病毒包装产品简介
腺病毒 是一种没有包膜的颗粒，其中的DNA以线性双链的形式存在。由于其 具有宿主范围广、可感染分裂和非分裂细胞、高滴度制备、外源基因装载容量大等优点，已被广泛地应用于基础研究和临床试验中，并且腺病毒载体已成为世界上最常用的基因治疗载体之一。
科维创生物采用的AdMax^TM重组腺病毒系统是将携带外源基因的腺病毒穿梭质粒与携带腺病毒基因组的包装质粒共转染包装细胞，借助Cre/loxP系统的作用重组产生腺病毒。该系统既克服了传统共转染系统重组效率低的缺点，也避免了细菌重组中的种种不确定性，实现了快速高效的腺病毒包装。
科维创生物 提供Ad5和Ad5/F35两种血清型腺病毒，凭借丰富的病毒基因载体研发经验，科维创生物在AdMax^TM包装系统基础上建立了Ad5/F35Max^TM载体包装系统。Ad5/F35是Ad5的病毒纤突（Fiber）被改造成35型腺病毒纤突的嵌合型腺病毒载体。其基因组中仅有fiber是嵌合的，其它的基因仍旧保留了Ad5载体的特征。其原理与AdMax系统相似。Ad5/F35腺病毒骨架质粒可以与带有loxP位点的穿梭质粒配合，通过Cre/loxP，使转染进包装细胞的穿梭质粒和骨架质粒发生定点重组，产生带有外源基因的重组腺病毒（Ad5/F35）。
科维创生物 提供的Ad5和Ad5/F35两种重组腺病毒均为复制缺陷型病毒，即病毒感染目的细胞后不会再感染其他细胞，也不会利用宿主细胞产生新的病毒颗粒，安全性能良好。
Ad5Max TM 腺病毒特点
1、复制缺陷型腺病毒颗粒，对分裂期和非分裂期细胞均有感染作用；
2、无需任何转染试剂，操作简单；
3、实验简便，时间短；
4、适用于在难以转染的细胞中进行RNA干扰、过表达特定基因或过表达特定microRNA研究和In vivo 实验；
5、不适用于感染腺病毒以后细胞发生死亡和分化的敏感细胞和需要长期稳定表达目的基因的实验。
Ad5/F35MaxTM腺病毒特点
除了保留常规Ad5Max系统出毒快、稳定性好、产率高等优点，Ad5/F35还具有其独特优势：
1、感染细胞的范围更广，对于Ad5感染效率相对低点神经胶质瘤细胞等具有很高的感染效率；
2、感染效率更高，对各种造血细胞和肿瘤细胞的感染效率高于普通Ad5；
3、外源基因表达量更多；
4、包装系统更高效更稳定。
服务流程
A、腺病毒穿梭载体的构建：
根据不同的研究需求构建腺病毒穿梭载体，如用于RNAi的腺病毒载体、用于基因过表达的腺病毒载体、用于启动子活性研究的腺病毒载体等；
B、 腺病毒包装过程：
将腺病毒穿梭质粒及其辅助包装质粒共转染至包装细胞中，通过Cre/loxP系统的作用实现重组，产生重组腺病毒颗粒。
提供产品
| 产品名称 | 病毒滴度 | 产品规格 | 赠送阴性对照病毒规格 |
| 非纯化腺病毒 | ＞10^10 PFU/ml | 1ml | 1ml (＞10^10 PFU/ml ) |
| 纯化腺病毒 | ＞10^11 PFU/ml | 1ml | 100ul (＞10^11 PFU/ml ) |
腺相关病毒AAV包装
腺相关病毒（Adeno-Associated Viral Vector，AAV）属于微小病毒科( parvovirus)，为无包膜的单链线状 DNA 病毒。AAV 的基因组约 4700bp，包括上下游两个开放读码框架(ORF)，位于分别由 145 个核苷酸组成的 2 个反向末端重复序列(ITR)之间。 由于腺相关病毒具有宿主范围广、安全性高、免疫原性低、表达稳定和物理性质稳定等优点，已被广泛地应用于基础研究和临床试验中，并且腺相关病毒载体已成为世界上最常用的基因治疗载体之一。
图 1. AAV 基因组结构
AAV病毒特点
1. 安全性高：迄今从未发现野生型 AAV 对人体致病，重组 AAV 基因组序列上去除了大部分的野生型 AAV 基因组元件，进一步保证了安全性；
2. 免疫原性低：AAV2 的基因组仅 4681 个核苷酸，便于用常规的重组 DNA技术进行操作，而且进行动物实验时造成的免疫反应小；
3. 宿主范围广：能感染分裂细胞和非分裂细胞；
4. 表达稳定：能介导基因的长期稳定表达；
5. 物理性质稳定：在 60℃不能被灭活，能抗氯仿；
AAV生物学特性
表1 不同病毒的生物学特性比较
| 慢病毒 | 逆转录病毒 | 腺相关病毒 | 腺病毒 | |
| 包膜 | 有 | 有 | 无 | 无 |
| 颗粒直径 | 90-100 nm | 90-100 nm | 20-30 nm | 60-90nm |
| 基因组 | dsRNA | dsRNA | ssDNA | dsDNA |
| 表达起始时间 | 48-72h | 48-72h | 72-96h | 24-48h |
| 表达持续时间 | > 2 months | > 2 months | > 6 months | ~1 month |
| 宿主基因组整合方式 | 随机高频整合 | 随机高频整合 | 定向低频整合或非整合 | 非整合 |
AAV载体不同血清型
研究发现 AAV 具有多种血清型，各种不同血清型的 AAV 载体的主要区别是衣壳蛋白不同，因此对不同的组织和细胞的转染效率存在差异。目前科维创生物在包装腺相关病毒时有 9 中不同的 AAV 血清型可供客户选择，建议客户针对不同组织器官选择相应血清型的 AAV 病毒，见表 2。
表2. 9种不同血清型AAV对各组织器官细胞的亲和性
| 血清型 | 组织亲和性 |
| AAV1 | 肌肉，心脏，骨骼肌（包括心肌），神经组织 |
| AAV2 | 中枢神经，肌肉，肝脏，脑组织，眼， |
| AAV3 | 肌肉，肝脏，肺，眼 |
| AAV4 | 中枢神经，肌肉，眼，脑 |
| AAV5 | 肺，眼，中枢神经，关节滑膜，胰腺 |
| AAV6 | 肺，心脏 |
| AAV7 | 肌肉，肝脏 |
| AAV8 | 肝脏，眼，中枢神经，肌肉 |
| AAV9 | 心脏，肌肉，肺（肺泡），肝脏，中枢神经 |
服务流程
AAV应用介绍
A. AAV9感染小鼠脑组织（PMID: 23503602）
B. AAV2感染大鼠脑组织
C. AAV2感染肾脏（PMID: 23216315）
D. AAV感染心脏（PMID: 20703310）
E. AAV9感染骨骼肌（PMID: 21811247）
F. AAV感染肝脏（PMID: 19861950）
