支原体清除试剂

货号：	MR002
供应商：	cobioer
数量：	999
保质期：	2年
保存条件：	-20℃
规格：	1ml

一、​​​​​​​​​​​​支原体简介
    支原体（Mycoplasma）是一种没有细胞壁的原核生物，大小约0.1 - 0.6微米。目前，已发现的支原体品种有100多种。其中，有20多种曾经在各种细胞培养体系中检测到，但超过98%以上的支原体污染是由6-8种引起的。而且同一种细胞经常被多种支原体污染。
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二、​​​​​​​​​​​​支原体污染细胞的途径
     由于支原体直径较小，经常可以穿过实验室常规的0.20微米孔径的除菌滤膜，高压过滤时，甚至可以穿过0.10微米孔径的除菌滤膜,造成细胞的支原体污染。细胞培养的支原体污染来源主要有：（1）细胞之间的交叉污染，这是支原体污染的最主要原因；（2）细胞培养操作人员的口腔、皮肤等。（3）细胞培养用的组分，如血清、培养液等；
 
三、​​​​​​​​​​​​支原体污染细胞的危害
    培养的细胞被支原体污染后，几乎可以改变细胞的所有功能，其可以导致细胞染色体的异常和损伤，改变细胞的代谢、生长、形状、附着，影响病毒的扩增能力和产量等等。例如，Miller CJ等人通过Microarray的研究表明：支原体污染严重改变被污染细胞的基因表达谱 [1, 2]，支原体污染后与无污染的同一细胞系相比，表达差异达2倍以上的基因就有200多个！！！（详细数据请见参考文献 1）。Edward Burnett 和 Liz Penn认为：被支原体污染的细胞系已经不是原来的细胞系，而是另外一个细胞系了 [3]！此外，严重的支原体污染将彻底摧毁一株细胞系。
   从2013年开始，《Nature》期刊已正式要求投稿的文章，如涉及细胞培养都要进行支原体检测。相信会有越来越多的高水平期刊将做出同样的支原体检测要求。
    ​总之，在细胞系上进行生物医学方面的科学研究，如果不能保证所用的细胞系无支原体污染（Mycoplasma-free），则所得出的结论是极端不可靠甚至是完全错误的！可以想象：全球范围内，每年因支原体污染导致白白浪费的科研经费的数量是多么的巨大，有人估计至少高达数十亿美金！
  
四、​​​​​​​​​​​​支原体污染细胞的比例
   据Corning公司报道，世界各国的细胞系都有不同程度的支原体污染，可以说支原体污染是细胞培养领域的一个世界性问题 [4]。表1是美国ATCC、FDA、以及其他两家细胞检测机构的支原体污染统计数据。表2是世界各国的细胞系污染比例。目前，世界各国细胞系支原体污染的平均比例为30-60%。
表1，细胞支原体污染统计结果，数据来自参考文献 [4]

表2，世界各国的细胞系污染比例，数据来自参考文献 [4]

细胞库	ATCC	FDA	DSMZ	Argentina	Japan-IFO	China
污染率	14%	15%	36%	65%	80%	?

 
​五、支原体清除试剂

1. 产品信息
2. 运输和储存

      该产品在常温下运输，收到产品后请放于-20 ℃保存，该条件下，至少可以保存2年。
产品用途
      该产品专用于杀灭和清除哺乳动物细胞培养液中污染的支原体。该产品仅用于基础研究，非临床用品。
 

1. 产品简介

   本公司开发的支原体清除试剂1含有抑制支原体蛋白质合成的药物，而支原体清除试剂2含有抑制支原体DNA合成的药物。由于两种试剂的作用机理不同，支原体清除试剂1需要处理不少于15天，而支原体清除试剂2只需处理7天。两者都可以达到永久杀灭和清除支原体的目的。
  大约5-10%的支原体会对清除试剂1或清除试剂2产生抗性，此外，也有3-5%左右的细胞会在杀灭支原体的过程中死亡，由于上述两个原因，我们一般建议同时购买两种支原体清除试剂，如果发现细胞被污染，可以将细胞分成两份，分别用清除试剂1和清除试剂2同时进行杀灭，这样支原体对两种药物同时产生抗性和处理过程中细胞同时死亡的概率会非常低。
 

1. 使用方法

（一）支原体清除试剂1

1. 使用之前，先将支原体清除试剂1用PBS或者无血清培养液稀释10倍后，放4℃冰箱保存。
2. 将50-100万个细胞铺到60 mm的细胞培养皿内，加入4 mL含支原体清除试剂1的正常细胞培养液（使用稀释10倍后的支原体清除试剂1，按1:100比例加入）。
3. 每2-3天更换细胞培养液，加入新鲜的含支原体清除试剂1的正常细胞培养液。期间如果细胞密度过大，请保持细胞密度适当（贴壁细胞可能需要胰酶消化），并更换新的培养皿。
4. 处理15天后，可以用支原体检测试剂盒进行检测，检测支原体是否杀灭完全。如果仍有支原体残留，可以考虑再处理6天。
5. 以后每隔1个月进行支原体的常规检测，以保证没有新的支原体污染。

（二）支原体清除试剂2

1. 使用之前，先将支原体清除试剂2（注意：支原体清除试剂2在-20 ℃保存后，解冻时可能会有细小的结晶析出）用PBS或者无血清培养液稀释10倍后（此时，支原体清除试剂2应该彻底溶解），放4℃冰箱保存。
2. 将50-100万个细胞铺到60 mm的细胞培养皿内，加入4 mL含支原体清除试剂2的正常细胞培养液（使用稀释10倍后的支原体清除试剂2，按1:100比例加入）。
3. 每天更换细胞培养液，加入新鲜的含支原体清除试剂2的正常细胞培养液。期间如果细胞密度过大，请保持细胞密度适当（贴壁细胞可能需要胰酶消化），并更换新的培养皿。
4. 处理7天后，可以用支原体检测试剂盒进行检测，检测支原体是否杀灭完全。如果仍有支原体残留，可以考虑再处理3天。
5. 以后每隔1个月进行支原体的常规检测，以保证没有新的支原体污染。

 

1. 注意事项

     建议将细胞分成两份，分别用清除试剂1和清除试剂2同时进行杀灭，这样支原体对两种药物同时产生抗性和处理过程中细胞同时死亡的概率会非常低。如果单独使用一种清除试剂的话，万一发现细胞对其中一种清除试剂有抗性或者细胞在处理过程中死亡，又要再花7-15天的时间尝试另外一种清除试剂的效果。
     处理过程中，注意每天观察细胞的状况，如果发现支原体清除试剂对细胞的毒性较大，可以加大培养液中的血清浓度或者提高细胞的密度。
     清除试剂1和清除试剂2在降低浓度后（使用稀释10倍后的支原体清除试剂1或者2，按1:500比例加入）也可以加入到培养液中作为短期（1-2个月）的支原体污染预防药物，但是不建议在细胞培养液中长期（超过2个月）加入，因为有可能导致对该两种药物有抗性的支原体出现。
 
六、支原体清除试剂的效果

左侧为未经支原体清除试剂处理的人Hela细胞,经DAPI染色后，除了细胞核为蓝色外，细胞质也有大量的絮状核酸物质被染成蓝色，这些处于细胞质的核酸物质就是支原体DNA。而右侧为经过本公司的支原体清除试剂2处理7天的Hela细胞，经DAPI染色后，除了细胞核为蓝色外，细胞质没有任何絮状核酸物质被染成蓝色，说明支原体已经被清除。
 
七、参考文献
1.     Miller CJ, Kassem HS, Pepper SD, Hey Y, Ward TH, Margison GP. Mycoplasma infection significantly alters microarray gene expression profiles. Biotechniques. 2003 Oct;35(4):812-4.
2.    Aldecoa-Otalora E, Langdon W, Cunningham P, Arno MJ. Unexpected presence of mycoplasma probes on human microarrays. Biotechniques. 2009 Dec;47(6):1013-5.
3.     Edward Burnett and Liz Penn, European Collection of Cell Culture (ECACC®). Mycoplasma Detection and Elimination. Don Finley, Market Segment Manager, Sigma® Life Science. Biofiles, Vol. 8, No. 18
4.     John Ryan (2008). "Understanding and Managing Cell Culture Contamination". Corning Incorporated. p. 24.