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外源蛋白单独表达T载体pBET-5
肝细胞培养
细胞鉴定
[VIP第1年] 指数:3
通过沈阳市浑南区市场监督管理局认证 
Wnt-11
CTNNG/γ-Catenin/JUP
GAPDH
10%SDS
P-JAK2（Tyr1007/1008
细胞增殖MTT/CCK-8
HUVEC
SH-SY5Y| 货号： | WLA079a |
| 保存条件： | -20℃ |
| 规格： | 50T |
产品概述：凝胶迁移实验又称凝胶阻滞实验或电泳迁移率实验（EMSA，electrophoretic mobility shift assay），是一种用于蛋白与核酸相互作用的技术。最初是用于转录因子与启动子相互作用的验证性实验，也可应用于蛋白-DNA、蛋白-RNA互作研究，通过EMSA可以研究目的蛋白和特定的DNA序列的结合情况，从而可以研究细胞内一些转录因子的激活水平。 本试剂盒中结合缓冲液（10X）中含有poly（dI-dC）等有效成分。其中poly（dI-dC）的浓度经过优化，可以很好的消除蛋白和标记探针间的非特异性结合，同时又不会减弱目的转录因子和标记探针间的结合。 本试剂盒提供了进行EMSA实验除探针外的所有试剂，使EMSA实验变得简单方便。
注意事项：
1. 需自备0.1%SDS、生物素标记的EMSA探针、非生物素标记的EMSA探针以及相对应的非生物素标记的突变探针，此外还需自备0.5XTBE用于预电泳、电泳以及转膜。
2. 如需做super-shift，需自备用于super-shift的抗体。
3. 本试剂盒包装以5孔为1板胶计算，有20板胶量以及50板胶量规格。
操作流程:
1. 探针退火。用TE缓冲液稀释引物，结合反应前等体积混合两条引物（生物素标记、非生物素标记以及非生物标记的突变探针），94℃退火引物 , 并自然冷却至4℃，待用。
2. 核蛋白提取。请使用万类生物核蛋白和浆蛋白提取试剂盒（WLA020a）具体提取过程请参考说明书。
3. 制备凝胶、电泳。
（1）制备6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶：（注意根据试剂情况按比例调整总体积）
| 试剂 | 体积 |
| 5XTBE | 1ml |
| 30%Acr–Bis | 2ml |
| 40% Glycerin | 625µl |
| DDW | 3.215ml |
| 10%AP | 150µl |
| TE | 10µl |
| 总计 | 7ml |
4. 形成探针-蛋白复合物。
阴性对照反应
| 试剂 | 体积 |
| DDW | 17.5µl |
| 结合缓冲液（10X） | 2µl |
| 核蛋白提取物 | 0 |
| 生物素标记探针 | 0.5µl |
| 总计 | 20µl |
样品反应
| 试剂 | 体积 |
| DDW | 17.5µl |
| 结合缓冲液（10X） | 2µl |
| 核蛋白提取物 | 4-10µg |
| 生物素标记探针 | 0.5µl |
| 总计 | 20µl |
探针冷竞争反应
| 试剂 | 体积 |
| DDW | 17.5µl |
| 结合缓冲液（10X） | 2µl |
| 核蛋白提取物 | 4-10µg |
| 未标记的探针 | 0.5µl |
| 生物素标记探针 | 0.5µl |
| 总计 | 20µl |
突变探针的冷竞争反应
| 试剂 | 体积 |
| DDW | 17.5µl |
| 结合缓冲液（10X） | 2µl |
| 核蛋白提取物 | 4-10µg |
| 未标记的探针 | 0.5µl |
| 生物素标记探针 | 0.5µl |
| 总计 | 20µl |
super-shift反应
| 试剂 | 体积 |
| DDW | 17.5µl |
| 结合缓冲液（10X） | 2µl |
| 核蛋白提取物 | 4-10µg |
| 目的蛋白特异抗体 | 0.5µl |
| 生物素标记探针 | 0.5µl |
| 总计 | 20µl |
按照上述顺序依次加入各种试剂，在加入标记好的探针前先混匀，并且室温放置10min，从而消除可能发生的探针与蛋白的特异性结合，或者让冷探针优先反应。之后加入标记好的探针，混匀，室温避光放置20-30min。
5. 电泳。加入5X上样缓冲液 5ul混匀，上样10-20ul，100V电泳至溴酚蓝于三分之二处。
6. 转膜。
（1）在预冷的0.5XTBE中浸泡凝胶，尼龙膜，滤纸和纤维垫。
（2）按以下顺序制作“三明治”：纤维垫，滤纸，凝胶，尼龙膜，滤纸，纤维垫。确保凝胶位于阴极，膜位于阳极。
（3）在预冷的0.5XTBE中进行转膜。转膜装置应置于冰上进行，300mA，40min。
7. 交联。转膜后，贴近胶的尼龙膜一面在紫外线下照射30min。
8. 封闭。交联后，加入15ml 封闭液 封闭30min。
9. 孵育。将HRP标记Streptavidin以1:5000稀释于12ml 封闭液中,摇床室温缓慢摇晃孵育20min。
10. 洗膜。
25ml 洗涤液Ⅰ 洗膜5min →25ml 洗涤液Ⅱ 洗膜15min →25ml 洗涤液 Ⅲ 洗膜5min，2次 →25ml 0.1%SDS in 2X检测 平衡液 洗膜5min，2次→25ml 0.1%SDS in 1X检测平衡液 洗膜10min，2次 →25 ml 0.1%SDS in 0.5X检测平衡液 洗膜 5min，2次。
11. ECL发光检测信号。
详情请致电咨询：400-602-0407（转2号键）或登录公司官网 www.wanleibio.cn
温馨提示：不可用于临床治疗。
