提供商: | 晶莱生物 |
服务名称: | 染色质免疫沉淀CHIP实验服务 |
规格: | 实验服务 |
染色质免疫共沉淀可以:
- 组蛋白修饰酶的抗体作为“生物标记”;
- 转录调控分析;
- 药物开发研究;
- DNA损失与凋亡分析。
一、细胞的甲醛交联与超声破碎(第一天)
1. 取出1平皿细胞(10 cm平皿),加入243 ul 37%甲醛,使得甲醛的终浓度为1%(培养基共有9 ml)。
2. 37℃孵育10 min。
3. 终止交联:加甘氨酸至终浓度为0.125 M。450 ul 2.5 M甘氨酸于平皿中。混匀后,在室温下放置5 min即可。
4. 吸尽培养基,用冰冷的PBS清洗细胞2次。
5. 细胞刮刀收集细胞于15 ml离心管中(PBS依次为5 ml,3 ml和3 ml)。预冷后2 000 rpm 5 min收集细胞。
6. 倒去上清。按照细胞量,加入SDS Lysis Buffer。使得细胞终浓度为每200ul含2×106个细胞。这样每100 ul溶液含1×106个细胞。再加入蛋白酶抑制剂复合物。假设MCF7长满板为5×106个细胞。本次细胞长得约为80%。即为4×106个细胞。因此每管加入400 ul SDS Lysis Buffer。将2管混在一起,共800 ul。
7. 超声破碎:VCX750,25%功率,4.5 s冲击,9 s间隙。共14次。
二、除杂及抗体哺育(第一天)
1. 超声破碎结束后,10 000 g 4℃离心10 min。去除不溶物质。
2. 留取300ul做实验,其余保存于-80℃。
3. 300 ul中,100 ul加抗体做为实验组;100 ul不加抗体做为对照组;100 ul加入4 ul 5 M NaCl(NaCl终浓度为0.2 M),65℃处理3 h解交联,跑电泳,检测超声破碎的效果。
4. 在100 ul的超声破碎产物中,加入900 ul ChIP DilutionBuffer和20 ul的50×PIC。
再各加入60 ul ProteinA Agarose/SalmonSpermDNA。4℃颠转混匀1 h。
5. 1 h后,在4℃静置10 min沉淀,700 rpm离心1 min。
6. 取上清。各留取20 ul做为input。一管中加入1 ul抗体,另一管中则不加抗体。4℃颠转过夜。
三、检验超声破碎的效果(第一天)
1. 取100 ul超声破碎后产物,加入4 ul 5M NaCl,65℃处理2 h解交联。
2. 分出一半用酚/氯0仿抽提。电泳检测超声效果。
四、免疫复合物的沉淀及清洗(第二天)
1. 孵育过夜后,每管中加入60 ul ProteinA Agarose/SalmonSperm DNA。4℃颠转2 h。
2. 4℃静置10 min后,700 rpm离心1 min。除去上清。
3. 依次用下列溶液清洗沉淀复合物。清洗的步骤:加入溶液,在4℃颠转10 min,4℃静置10 min沉淀,700 rpm离心1 min,除去上清。
洗涤溶液:
(1)low salt wash buffer-one wash
(2)highsalt wash buffer-one wash
(3)LiCl wash buffer-one wash
(4)TE buffer-two wash
4. 清洗完毕后,开始洗脱。
洗脱液的配方:100 ul 10%SDS,100 ul1M NaHCO3,800 ul ddH2O,共1 ml。
每管加入250 ul洗脱buffer,室温下颠转15 min,静置离心后,收集上清。重复洗涤一次。最终的洗脱液为每管500 ul。
5. 解交联:每管中加入20 ul 5M NaCl(NaCl终浓度为0.2 M)。
6. 混匀,65℃解交联过夜。
五、DNA样品的回收(第三天)
1. 解交联结束后,每管加入1 ul RNaseA(MBI),37℃孵育1 h。
2. 每管加入10 ul 0.5 M EDTA,20 ul1M Tris.HCl(PH6.5),2 ul 10 mg/ml蛋白酶K。45℃处理2 h。
3. DNA片段的回收----omega胶回收试剂盒。最终的样品溶于100 ul ddH2O。
六、PCR分析(第三天)
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