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WB 免疫印迹,Western Blot,Realtime PCR,ICC ,IHC,Transwell,细胞培养/SCI论文发表

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2021-05-31 01:30:04
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产品详情

品牌名称:
提供商: hongli
服务名称: WB 免疫印迹,Realtime PCR,,ICC ,IHC,Transwell,细胞培养等实验技术服务
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Western Blot实验
成功完成Western Blot检测,必须满足4个条件:

凝胶洗脱:转移期间蛋白质必须从凝胶中洗脱出来,如果蛋白质还截留在凝胶中,将无法在膜上进行分析

吸附到膜上:在转移过程中蛋白质必须吸附到膜上,如果蛋白不吸附,将无法在膜上进行分析

处理期间仍截留在膜上:在转移后的处理过程中蛋白质必须保持吸附在印迹膜上

处理过程中可接近:被吸附的蛋白质必须能够与检测试剂接触,如果蛋白质被掩盖则无法检测

成功进行WB检测,则设置合适正确的对照是必不可少的,只要正确设置了这些对照,即可快速和准确的找到WB的问题所在,并保证实验结果的准确性和特异性!一般需要设置的对照如下:

阳性对照:明确表达检测蛋白的组织或细胞,用于检测抗体的工作效率

阴性对照:明确不表达检测蛋白组织或细胞,用于检测抗体的特异性

二抗对照:不加一抗,用于检测二抗的特异性

内参对照:检测标本的质量和二抗系统

空白对照:不加一抗和二抗;用于检测膜的性质和封闭的效果 

WB 检测基本过程 

1 、获取细胞或组织裂解物 

1)根据检测蛋白的位置选择合适的裂解buffer:
 
蛋白位置 
 
推荐buffer
 
全细胞
 
NP-40 or RIPA
 
胞浆(可溶性蛋白)
 
Tris-HCl
 
胞浆(骨架结合蛋白)
 
Tris-Triton
 
膜蛋白
 
NP-40 or RIPA
 
核蛋白
 
RIPA or 核蛋白提取试剂盒
 
线粒体蛋白
 
RIPA or 线粒体分离试剂盒
 
亦可购买商业化的蛋白提取试剂盒来保证标本制备的质量

2)选择合适的蛋白酶抑制剂,避免蛋白降解,从而保证检测的准确性!

2 、蛋白定量 

常用的蛋白定量方法:Bradford assay, Lowry assay 或BCA assay。定量后,可根据情况将标本保存在-20°C /-80°C备用,进行免疫沉淀(IP)或者直接进行电泳分离蛋白

3 、电泳分离蛋白质 

根据待测蛋白状态确定电泳条件: 
 
待测蛋白状态
 
凝胶条件
 
上样buffer
 
电泳buffer
 
Reduced - Denatured
 
还原,变性
 
含β-巯基乙醇或DTT,含SDS
 
含SDS
 
Reduced - Native
 
还原,不变性
 
含β-巯基乙醇或DTT,不含SDS
 
不含SDS
 
Oxidized - Denatured
 
不还原,变性
 
不含β-巯基乙醇或DTT,含SDS
 
含SDS
 
Oxidized - Native
 
不还原,不变性
 
不含β-巯基乙醇或DTT,不含SDS
 
不含SDS
 
根据待测蛋白分子量大小确定凝胶浓度
 
蛋白分子量(kDa)
 
凝胶浓度(%)
 
4-40
 
20
 
12-45
 
15
 
10-70
 
12.5
 
15-100
 
10
 
25-200
 
8
 
4 、转膜 

根据不同的检测目的和待测蛋白的特性,选择合适的膜类型。常用的转移膜类型有:PVDF膜、硝酸纤维素膜(NC膜)和尼龙膜,其中PVDF和NC膜的使用频率最高。各种膜的技术参数及比较如下:
 
 
 
PVDF膜
 
NC膜
 
尼龙膜
 
灵敏度和分辨率
 

 

 

 
背景
 

 

 
较高
 
蛋白结合能力
 
100-200ug/cm2(适用于SDS存在时与蛋白结合)
 
80-100ug/cm2
 
>400ug/cm2
 
机械强度
 

 
干的膜易脆
 
软而结实
 
溶剂抗性
 

 

 

 
使用前是否需要浸润
 
100%甲醛润湿
 
缓冲液润湿
 
缓冲液润湿
 
适用染色方法
 
胶体金、丽春红、酰胺黑、印度墨汁、考马斯亮兰
 
胶体金、丽春红、酰胺黑、印度墨汁
 
不能用阴离子染料
 
适用检测方法
 
显色法、化学发光、荧光、放射性、化学荧光、快速免疫检测
 
显色法、化学发光、荧光、放射性
 
显色、化学发光、放射性
 
适用范围
 
普通蛋白WB、糖蛋白检测、蛋白质测序、氨基酸分析、重复检测
 
普通蛋白WB、氨基酸分析、重复检测。0.1um膜适用于7kDa以下蛋白
 
低浓度小分子蛋白、酸性蛋白、糖蛋白、蛋白多糖、核酸检测常用
 
价格
 

 
较低
 

 
5 、封闭 

去掉膜上多余的非特异性结合位点,降低背景。常用的封闭溶液有:含BSA或者脱脂奶粉的TBST或TBS

6 、一抗孵育 

一抗的选择成功与否,是整个WB实验成功的关键:选择一抗有以下几个注意点:

选择适合检测标本种属的一抗(说明书有验证)

选择适用于WB实验方法的一抗(说明书有验证)

选择单克隆抗体或者经过亲和纯化的多克隆抗体

一抗的保存和使用:

根据说明书的要求条件进行抗体的保存;一般需要将抗体分装后放入-20度保存,绝对避免反复冻融。

抗体的工作液最好现配现用,在4度保存最好不要超过2周

根据说明书推荐浓度使用TBST稀释一抗。由于实验室条件和检测方法等的差异,说明书推荐的稀释比例只作参考,需要在说明书推荐的浓度周边进行多个浓度梯 度的实验检测,然后选择信噪比最好的抗体浓度进行实验。如果说明书没有推荐浓度,可进行多个稀释比例进行摸索最佳稀释度(1:100-1:3000)。

孵育条件:推荐4°C孵育过夜(一般大于18个小时),根据抗体亲和力不同孵育时间有所区别

内参的选择和使用:WB 过程监测以及目的蛋白定量的标准! 

WB常用内参及其技术参数:
 
内参名称
 
分子量大小
 
适用范围
 
beta-actin
 
43kDa
 
胞浆和全细胞
 
GAPDH
 
30-40kDa
 
胞浆和全细胞
 
Tubulin
 
55kDa
 
胞浆和全细胞
 
VCDA1/Porin
 
31kDa
 
线粒体
 
COXIV
 
16kDa
 
线粒体
 
TBP
 
38kDa
 
细胞核
 
详情请参考

7 、二抗孵育 

根据说明书推荐浓度使用TBST稀释一抗。如果说明书没有推荐浓度,可进行多个稀释比例进行摸索最佳稀释度(1:1000-1:20000)。孵育条件一般为室温1-2小时

8 、底物孵育 

选择显色或者化学发光底物。一般倾向于化学发光,灵敏度高且背景低,节省抗体用量

9 、结果分析和检测 

凝胶成像系统检测或者暗室曝光到胶片

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