点击图片查看原图
免疫印迹实验
免疫荧光
代做免疫荧光课题实验
通过嘉定区市场监管局认证 
ChIP染色质免疫共沉淀
免疫荧光
RIP RNA免疫共沉淀技
lucifrase双荧光素酶
transwell技术服务
Western Blot技术服务| 提供商： | hongli |
| 服务名称： | WB 免疫印迹，Realtime PCR,，ICC ，IHC，Transwell，细胞培养等实验技术服务 |
实验咨询专线 13817159308（24小时）
实验咨询邮箱：baisong0727@163.com
实验咨询QQ: 1624720515
Western Blot实验
成功完成Western Blot检测，必须满足4个条件：
凝胶洗脱：转移期间蛋白质必须从凝胶中洗脱出来，如果蛋白质还截留在凝胶中，将无法在膜上进行分析
吸附到膜上：在转移过程中蛋白质必须吸附到膜上，如果蛋白不吸附，将无法在膜上进行分析
处理期间仍截留在膜上：在转移后的处理过程中蛋白质必须保持吸附在印迹膜上
处理过程中可接近：被吸附的蛋白质必须能够与检测试剂接触，如果蛋白质被掩盖则无法检测
成功进行WB检测，则设置合适正确的对照是必不可少的，只要正确设置了这些对照，即可快速和准确的找到WB的问题所在，并保证实验结果的准确性和特异性！一般需要设置的对照如下：
阳性对照：明确表达检测蛋白的组织或细胞，用于检测抗体的工作效率
阴性对照：明确不表达检测蛋白组织或细胞，用于检测抗体的特异性
二抗对照：不加一抗，用于检测二抗的特异性
内参对照：检测标本的质量和二抗系统
空白对照：不加一抗和二抗；用于检测膜的性质和封闭的效果
WB 检测基本过程
1 、获取细胞或组织裂解物
1)根据检测蛋白的位置选择合适的裂解buffer：
| 蛋白位置 | 推荐buffer |
| 全细胞 | NP-40 or RIPA |
| 胞浆（可溶性蛋白） | Tris-HCl |
| 胞浆（骨架结合蛋白） | Tris-Triton |
| 膜蛋白 | NP-40 or RIPA |
| 核蛋白 | RIPA or 核蛋白提取试剂盒 |
| 线粒体蛋白 | RIPA or 线粒体分离试剂盒 |
2)选择合适的蛋白酶抑制剂，避免蛋白降解，从而保证检测的准确性！
2 、蛋白定量
常用的蛋白定量方法：Bradford assay, Lowry assay 或BCA assay。定量后，可根据情况将标本保存在-20°C /-80°C备用，进行免疫沉淀（IP）或者直接进行电泳分离蛋白
3 、电泳分离蛋白质
根据待测蛋白状态确定电泳条件：
| 待测蛋白状态 | 凝胶条件 | 上样buffer | 电泳buffer |
| Reduced - Denatured | 还原，变性 | 含β-巯基乙醇或DTT，含SDS | 含SDS |
| Reduced - Native | 还原，不变性 | 含β-巯基乙醇或DTT，不含SDS | 不含SDS |
| Oxidized - Denatured | 不还原，变性 | 不含β-巯基乙醇或DTT，含SDS | 含SDS |
| Oxidized - Native | 不还原，不变性 | 不含β-巯基乙醇或DTT，不含SDS | 不含SDS |
| 蛋白分子量（kDa） | 凝胶浓度（％） |
| 4-40 | 20 |
| 12-45 | 15 |
| 10-70 | 12.5 |
| 15-100 | 10 |
| 25-200 | 8 |
根据不同的检测目的和待测蛋白的特性,选择合适的膜类型。常用的转移膜类型有:PVDF膜、硝酸纤维素膜（NC膜）和尼龙膜，其中PVDF和NC膜的使用频率最高。各种膜的技术参数及比较如下：
| | PVDF膜 | NC膜 | 尼龙膜 |
| 灵敏度和分辨率 | 高 | 高 | 高 |
| 背景 | 低 | 低 | 较高 |
| 蛋白结合能力 | 100-200ug/cm2（适用于SDS存在时与蛋白结合） | 80-100ug/cm2 | >400ug/cm2 |
| 机械强度 | 强 | 干的膜易脆 | 软而结实 |
| 溶剂抗性 | 强 | 差 | 差 |
| 使用前是否需要浸润 | 100%甲醛润湿 | 缓冲液润湿 | 缓冲液润湿 |
| 适用染色方法 | 胶体金、丽春红、酰胺黑、印度墨汁、考马斯亮兰 | 胶体金、丽春红、酰胺黑、印度墨汁 | 不能用阴离子染料 |
| 适用检测方法 | 显色法、化学发光、荧光、放射性、化学荧光、快速免疫检测 | 显色法、化学发光、荧光、放射性 | 显色、化学发光、放射性 |
| 适用范围 | 普通蛋白WB、糖蛋白检测、蛋白质测序、氨基酸分析、重复检测 | 普通蛋白WB、氨基酸分析、重复检测。0.1um膜适用于7kDa以下蛋白 | 低浓度小分子蛋白、酸性蛋白、糖蛋白、蛋白多糖、核酸检测常用 |
| 价格 | 高 | 较低 | 低 |
去掉膜上多余的非特异性结合位点，降低背景。常用的封闭溶液有：含BSA或者脱脂奶粉的TBST或TBS
6 、一抗孵育
一抗的选择成功与否，是整个WB实验成功的关键：选择一抗有以下几个注意点：
选择适合检测标本种属的一抗（说明书有验证）
选择适用于WB实验方法的一抗（说明书有验证）
选择单克隆抗体或者经过亲和纯化的多克隆抗体
一抗的保存和使用：
根据说明书的要求条件进行抗体的保存；一般需要将抗体分装后放入-20度保存，绝对避免反复冻融。
抗体的工作液最好现配现用，在4度保存最好不要超过2周
根据说明书推荐浓度使用TBST稀释一抗。由于实验室条件和检测方法等的差异，说明书推荐的稀释比例只作参考，需要在说明书推荐的浓度周边进行多个浓度梯 度的实验检测，然后选择信噪比最好的抗体浓度进行实验。如果说明书没有推荐浓度，可进行多个稀释比例进行摸索最佳稀释度（1:100-1:3000）。
孵育条件：推荐4°C孵育过夜（一般大于18个小时），根据抗体亲和力不同孵育时间有所区别
内参的选择和使用：WB 过程监测以及目的蛋白定量的标准！
WB常用内参及其技术参数：
| 内参名称 | 分子量大小 | 适用范围 |
| beta-actin | 43kDa | 胞浆和全细胞 |
| GAPDH | 30-40kDa | 胞浆和全细胞 |
| Tubulin | 55kDa | 胞浆和全细胞 |
| VCDA1/Porin | 31kDa | 线粒体 |
| COXIV | 16kDa | 线粒体 |
| TBP | 38kDa | 细胞核 |
7 、二抗孵育
根据说明书推荐浓度使用TBST稀释一抗。如果说明书没有推荐浓度，可进行多个稀释比例进行摸索最佳稀释度（1:1000-1:20000）。孵育条件一般为室温1-2小时
8 、底物孵育
选择显色或者化学发光底物。一般倾向于化学发光，灵敏度高且背景低，节省抗体用量
9 、结果分析和检测
凝胶成像系统检测或者暗室曝光到胶片
