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分子生物学：探针合成实验服务
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Western Blot技术服务| 提供商： | 鸿立生物 |
| 服务名称： | lucifrase荧光素酶报告基因 |
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实验咨询邮箱：baisong0727@163.com
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1，荧光素酶报告基因野生型以及突变型载体的构建
根据软件预测结合序列，选取启动子转录起始位点上游300bp到下游200bp的序列，利用PCR扩增，并在两端分别引入限制性内切酶位点KpnI和MluI。突变型用引物搭桥方法引入ERE突变位点。
引入突变位点引物： MUT-5：
MUT-3：
引物由上海生工生物工程有限公司合成。
1.2 PCR扩增目的片段
以人基因组DNA为模板，用1.1中引物PCR扩增目的片段。
反应体系：
反应条件：94℃变性5分钟；然后94℃变性30秒，55℃退火40秒，72℃延伸50秒，进行30个循环；最后72℃延伸8分钟，4℃保温。扩增片段用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。
1.3酶切PCR产物和空载体以及连接。
扩增获得的DNA片段5’端含有KpnI限制性内切酶酶切位点（GGTAC^C），3’端含有MluI限制性内切酶酶切位点（A^CGCGT）以KpnI和MluI对目的基因片段和pGL3.0 basic报告基因载体分别进行双酶切，并使用T4连接酶将目的基因和载体连接。连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，含氨苄青霉素的LB板筛选阳性克隆，PCR及酶切鉴定，并测序。
KpnI和MluI双酶切反应按照以下体系，37℃ 3h。
2，ERα过表达载体质粒的构建
根据NCBI提供编码序列（cDNA序列），在其两端设计引物，利用PCR扩增并在两端分别引入限制性内切酶位点XhoI和EcoRI。
2.2 PCR扩增目的片段
以SKOV3的cDNA为模板，用2.1中引物PCR扩增目的片段。
反应体系：
反应条件：94℃变性5分钟；然后94℃变性30秒，55℃退火40秒，72℃延伸50秒，进行30个循环；最后72℃延伸8分钟，4℃保温。扩增片段用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。
2.3酶切PCR产物和空载体以及连接。
扩增获得的DNA片段5’端含有XhoI限制性内切酶酶切位点（C^TCGAG），3’端含有EcoRI限制性内切酶酶切位点（G^AATTC）以XhoI和EcoRI对目的基因片段和pcDNA3.1(-)真核表达载体分别进行双酶切，并使用T4连接酶将目的基因和载体连接。连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，含氨苄青霉素的LB板筛选阳性克隆，PCR及酶切鉴定，并测序。
Xho I和EcoRI双酶切反应按照以下体系，37℃ 3h。
3，质粒转化
3.1 DH5α感受态细胞的制备
取单菌落接种于1支15 ml无菌培养试管中，37℃剧烈振荡培养过夜，至其饱和。另取1个250 ml无菌三角烧瓶，内装200 ml LB培养液。从上述培养物中取1 ml加入其中，37℃，250-300 rpm培养2-4 h，使之OD600=0.4。无菌条件下将之分装、离心（4℃，4000 rpm，10 min）。弃上清，在无菌纸巾上倒置1 min，流尽培液。将沉淀重悬于冰预冷的30 ml 0.1 M CaCl2, 混匀。相同条件下离心，弃上清。然后加入8 ml冰预冷的0.1 M CaCl2，重悬，加入20%（V/V）甘油，冰浴条件下分装，置于4℃备用或立即冻存于-70℃冰箱中。
2.2质粒转化大肠杆菌
重组质粒1μl或连接产物10μl加入100μl的DH5α感受态细胞中，冰浴30 min。随后42℃热休克90 sec，冰上冷却3-5 min。无菌条件下加入800μl LB培液，37℃振荡培养45 min以复苏细菌。离心4000转，2min，弃去LB培液，混匀菌液，均匀涂布于抗生素筛选平板上（LBA板），置于37℃温箱中孵育2 h后倒置平板，继续培养12-16 h。
3 质粒中量抽提（Qiagen公司试剂盒）
3.1 从新鲜LBA板上挑取单个克隆至5ml LBA培养基中。37℃，300rpm，8h。
3. 2 取500μl上述培液，放大至100ml LBA中。37℃，300rpm，12-16h。
3. 3 收获细胞。4℃，6000g，离心15min。
3. 4 用4ml Buffer P1悬浮细菌沉淀。确保沉淀完全散开，无可见细菌团块。
3.5 加入4ml Buffer P2，立即混匀并剧烈颠倒4-6次，室温孵育5min，使细菌完全裂解。
3. 6 加入4ml Buffer P3，立即混匀并剧烈颠倒4-6次，冰上孵育15min。
3. 7 4℃，≥20000g，离心30min。将含有质粒DNA的上清敏捷地转移至另一洁净离心管。
3. 8 4℃，≥20000g，离心15min。
3. 9 离心的同时，用4ml Buffer QBT 平衡QIAGEN-tip 100柱，在重力作用下流净。
3. 10 将第8步的上清转移至QIAGEN-tip 100柱，在重力作用下流净。
3. 11 用10ml Buffer QC洗涤QIAGEN-tip 100柱2次。
3. 12 用5ml Buffer QF洗脱结合于柱上的质粒DNA。
3. 13 加入3.5 ml 异丙醇沉淀质粒DNA。4℃，15000g，离心30min。
3. 14 用2ml 70%乙醇洗涤沉淀。15000g，离心10min。弃上清。
3. 15 室温放置5-10min，100μl去离子水溶解DNA。
4,细胞转染
将处于对数生长期的细胞用胰酶消化接种于24孔板中，培养24h
后在细胞融合达80%左右时进行转染。分别将启动子野生型载体、启动子突变型载体、表达载体、renilla质粒加入到无血清RPMI1640 (转染终浓度为40 nM)，同时将脂质体也混于相应的无血清培养液中。然后将混了脂质体的无血清培养基加入装有质粒的无血清培养基，混合20 min后加入细胞培养液中。具体操作按Lipofectamine 2000脂质体说明书。36-48h后，收细胞测定报告基因荧光素酶活性。
5, Luciferase报告基因荧光素酶活性测定
根据Promega公司的产品说明书进行测定luciferase报告基因活性。
用1X PBS清洗24孔板内转染了质粒的细胞，扣干后加入1X的细胞裂解液100μl,室温摇晃1小时。然后取10μl细胞裂解产物加入反应杯中,并加入20μl substrate A混匀，测定活性，得出luciferase的值A，然后加入20μl substrate B混匀，立即放入Luminometer中测定renilla的活性值B。每一孔中A与B的比值即为该孔的活性值。
根据软件预测结合序列，选取启动子转录起始位点上游300bp到下游200bp的序列，利用PCR扩增，并在两端分别引入限制性内切酶位点KpnI和MluI。突变型用引物搭桥方法引入ERE突变位点。
引入突变位点引物： MUT-5：
MUT-3：
引物由上海生工生物工程有限公司合成。
1.2 PCR扩增目的片段
以人基因组DNA为模板，用1.1中引物PCR扩增目的片段。
反应体系：
| 10×Taq Buffer | 2.5μl |
| dNTP(10mM) | 2μl |
| Primer 1 | 1μl |
| Primer 2 | 1μl |
| Taq 酶 | 0.5μl |
| cDNA | 2μl |
| ddH2O | 16μl |
| Total | 25μl |
反应条件：94℃变性5分钟；然后94℃变性30秒，55℃退火40秒，72℃延伸50秒，进行30个循环；最后72℃延伸8分钟，4℃保温。扩增片段用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。
1.3酶切PCR产物和空载体以及连接。
扩增获得的DNA片段5’端含有KpnI限制性内切酶酶切位点（GGTAC^C），3’端含有MluI限制性内切酶酶切位点（A^CGCGT）以KpnI和MluI对目的基因片段和pGL3.0 basic报告基因载体分别进行双酶切，并使用T4连接酶将目的基因和载体连接。连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，含氨苄青霉素的LB板筛选阳性克隆，PCR及酶切鉴定，并测序。
KpnI和MluI双酶切反应按照以下体系，37℃ 3h。
| 10×NEB Buffer | 2μl |
| PCR产物 | 1μg |
| KpnI | 0.5μl |
| MluI | 0.5μl |
| BSA | 0.2μl |
| ddH2O | 11.8μl |
| Total | 20ul |
2，ERα过表达载体质粒的构建
根据NCBI提供编码序列（cDNA序列），在其两端设计引物，利用PCR扩增并在两端分别引入限制性内切酶位点XhoI和EcoRI。
2.2 PCR扩增目的片段
以SKOV3的cDNA为模板，用2.1中引物PCR扩增目的片段。
反应体系：
| 10×Taq Buffer | 2.5μl |
| dNTP(10mM) | 2μl |
| Primer 1 | 1μl |
| Primer 2 | 1μl |
| Taq 酶 | 0.5μl |
| cDNA | 2μl |
| ddH2O | 16μl |
| Total | 25μl |
2.3酶切PCR产物和空载体以及连接。
扩增获得的DNA片段5’端含有XhoI限制性内切酶酶切位点（C^TCGAG），3’端含有EcoRI限制性内切酶酶切位点（G^AATTC）以XhoI和EcoRI对目的基因片段和pcDNA3.1(-)真核表达载体分别进行双酶切，并使用T4连接酶将目的基因和载体连接。连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，含氨苄青霉素的LB板筛选阳性克隆，PCR及酶切鉴定，并测序。
Xho I和EcoRI双酶切反应按照以下体系，37℃ 3h。
| 10×NEB Buffer | 2μl |
| PCR产物 | 1μg |
| XhoI | 0.5μl |
| EcoRI | 0.5μl |
| BSA | 0.2μl |
| ddH2O | 11.8μl |
| Total | 20ul |
3，质粒转化
3.1 DH5α感受态细胞的制备
取单菌落接种于1支15 ml无菌培养试管中，37℃剧烈振荡培养过夜，至其饱和。另取1个250 ml无菌三角烧瓶，内装200 ml LB培养液。从上述培养物中取1 ml加入其中，37℃，250-300 rpm培养2-4 h，使之OD600=0.4。无菌条件下将之分装、离心（4℃，4000 rpm，10 min）。弃上清，在无菌纸巾上倒置1 min，流尽培液。将沉淀重悬于冰预冷的30 ml 0.1 M CaCl2, 混匀。相同条件下离心，弃上清。然后加入8 ml冰预冷的0.1 M CaCl2，重悬，加入20%（V/V）甘油，冰浴条件下分装，置于4℃备用或立即冻存于-70℃冰箱中。
2.2质粒转化大肠杆菌
重组质粒1μl或连接产物10μl加入100μl的DH5α感受态细胞中，冰浴30 min。随后42℃热休克90 sec，冰上冷却3-5 min。无菌条件下加入800μl LB培液，37℃振荡培养45 min以复苏细菌。离心4000转，2min，弃去LB培液，混匀菌液，均匀涂布于抗生素筛选平板上（LBA板），置于37℃温箱中孵育2 h后倒置平板，继续培养12-16 h。
3 质粒中量抽提（Qiagen公司试剂盒）
3.1 从新鲜LBA板上挑取单个克隆至5ml LBA培养基中。37℃，300rpm，8h。
3. 2 取500μl上述培液，放大至100ml LBA中。37℃，300rpm，12-16h。
3. 3 收获细胞。4℃，6000g，离心15min。
3. 4 用4ml Buffer P1悬浮细菌沉淀。确保沉淀完全散开，无可见细菌团块。
3.5 加入4ml Buffer P2，立即混匀并剧烈颠倒4-6次，室温孵育5min，使细菌完全裂解。
3. 6 加入4ml Buffer P3，立即混匀并剧烈颠倒4-6次，冰上孵育15min。
3. 7 4℃，≥20000g，离心30min。将含有质粒DNA的上清敏捷地转移至另一洁净离心管。
3. 8 4℃，≥20000g，离心15min。
3. 9 离心的同时，用4ml Buffer QBT 平衡QIAGEN-tip 100柱，在重力作用下流净。
3. 10 将第8步的上清转移至QIAGEN-tip 100柱，在重力作用下流净。
3. 11 用10ml Buffer QC洗涤QIAGEN-tip 100柱2次。
3. 12 用5ml Buffer QF洗脱结合于柱上的质粒DNA。
3. 13 加入3.5 ml 异丙醇沉淀质粒DNA。4℃，15000g，离心30min。
3. 14 用2ml 70%乙醇洗涤沉淀。15000g，离心10min。弃上清。
3. 15 室温放置5-10min，100μl去离子水溶解DNA。
4,细胞转染
将处于对数生长期的细胞用胰酶消化接种于24孔板中，培养24h
后在细胞融合达80%左右时进行转染。分别将启动子野生型载体、启动子突变型载体、表达载体、renilla质粒加入到无血清RPMI1640 (转染终浓度为40 nM)，同时将脂质体也混于相应的无血清培养液中。然后将混了脂质体的无血清培养基加入装有质粒的无血清培养基，混合20 min后加入细胞培养液中。具体操作按Lipofectamine 2000脂质体说明书。36-48h后，收细胞测定报告基因荧光素酶活性。
5, Luciferase报告基因荧光素酶活性测定
根据Promega公司的产品说明书进行测定luciferase报告基因活性。
用1X PBS清洗24孔板内转染了质粒的细胞，扣干后加入1X的细胞裂解液100μl,室温摇晃1小时。然后取10μl细胞裂解产物加入反应杯中,并加入20μl substrate A混匀，测定活性，得出luciferase的值A，然后加入20μl substrate B混匀，立即放入Luminometer中测定renilla的活性值B。每一孔中A与B的比值即为该孔的活性值。
