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脂类代谢组学分析服务
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ChIP染色质免疫共沉淀
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RIP RNA免疫共沉淀技
lucifrase双荧光素酶
WB 免疫印迹，Western
transwell技术服务| 提供商： | 鸿立生物 |
| 服务名称： | Western Blot 蛋白免疫印迹服务 |
| 规格： | 每张膜 |
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Western Blot实验 成功完成Western Blot检测，必须满足4个条件： 凝胶洗脱：转移期间蛋白质必须从凝胶中洗脱出来，如果蛋白质还截留在凝胶中，将无法在膜上进行分析 吸附到膜上：在转移过程中蛋白质必须吸附到膜上，如果蛋白不吸附，将无法在膜上进行分析 处理期间仍截留在膜上：在转移后的处理过程中蛋白质必须保持吸附在印迹膜上 处理过程中可接近：被吸附的蛋白质必须能够与检测试剂接触，如果蛋白质被掩盖则无法检测 成功进行WB检测，则设置合适正确的对照是必不可少的，只要正确设置了这些对照，即可快速和准确的找到WB的问题所在，并保证实验结果的准确性和特异性！一般需要设置的对照如下： 阳性对照：明确表达检测蛋白的组织或细胞，用于检测抗体的工作效率 阴性对照：明确不表达检测蛋白组织或细胞，用于检测抗体的特异性 二抗对照：不加一抗，用于检测二抗的特异性 内参对照：检测标本的质量和二抗系统 空白对照：不加一抗和二抗；用于检测膜的性质和封闭的效果 WB 检测基本过程 1 、获取细胞或组织裂解物 1)根据检测蛋白的位置选择合适的裂解buffer：
2)选择合适的蛋白酶抑制剂，避免蛋白降解，从而保证检测的准确性！ 2 、蛋白定量 常用的蛋白定量方法：Bradford assay, Lowry assay 或BCA assay。定量后，可根据情况将标本保存在-20°C /-80°C备用，进行免疫沉淀（IP）或者直接进行电泳分离蛋白 3 、电泳分离蛋白质 根据待测蛋白状态确定电泳条件：
根据不同的检测目的和待测蛋白的特性,选择合适的膜类型。常用的转移膜类型有:PVDF膜、硝酸纤维素膜（NC膜）和尼龙膜，其中PVDF和NC膜的使用频率最高。各种膜的技术参数及比较如下：
去掉膜上多余的非特异性结合位点，降低背景。常用的封闭溶液有：含BSA或者脱脂奶粉的TBST或TBS 6 、一抗孵育 一抗的选择成功与否，是整个WB实验成功的关键：选择一抗有以下几个注意点： 选择适合检测标本种属的一抗（说明书有验证） 选择适用于WB实验方法的一抗（说明书有验证） 选择单克隆抗体或者经过亲和纯化的多克隆抗体 一抗的保存和使用： 根据说明书的要求条件进行抗体的保存；一般需要将抗体分装后放入-20度保存，绝对避免反复冻融。 抗体的工作液最好现配现用，在4度保存最好不要超过2周 根据说明书推荐浓度使用TBST稀释一抗。由于实验室条件和检测方法等的差异，说明书推荐的稀释比例只作参考，需要在说明书推荐的浓度周边进行多个浓度梯度的实验检测，然后选择信噪比最好的抗体浓度进行实验。如果说明书没有推荐浓度，可进行多个稀释比例进行摸索最佳稀释度（1:100-1:3000）。 孵育条件：推荐4°C孵育过夜（一般大于18个小时），根据抗体亲和力不同孵育时间有所区别 内参的选择和使用：WB 过程监测以及目的蛋白定量的标准！ WB常用内参及其技术参数：
7 、二抗孵育 根据说明书推荐浓度使用TBST稀释一抗。如果说明书没有推荐浓度，可进行多个稀释比例进行摸索最佳稀释度（1:1000-1:20000）。孵育条件一般为室温1-2小时 8 、底物孵育 选择显色或者化学发光底物。一般倾向于化学发光，灵敏度高且背景低，节省抗体用量 9 、结果分析和检测 凝胶成像系统检测或者暗室曝光到胶片 |
