点击图片查看原图
抗体F(ab')2片段的制备
免疫组化检测
ELISA检测试剂盒开发
通过嘉定区市场监管局认证 
免疫印迹western实验
myc标签抗体偶联affin
flag标签抗体偶联affi
HA标签抗体偶联affini
WB实验外包
GFP标签抗体偶联affin
Western Blot实验代做| 提供商： | 上海维景生物 |
| 服务名称： | 免疫印迹 |
| 规格： | 每个样本150元 |
Western Blot标准protocol
成功完成Western Blot检测，必须满足4个条件：
- 凝胶洗脱：转移期间蛋白质必须从凝胶中洗脱出来，如果蛋白质还截留在凝胶中，将无法在膜上进行分析
- 吸附到膜上：在转移过程中蛋白质必须吸附到膜上，如果蛋白不吸附，将无法在膜上进行分析
- 处理期间仍截留在膜上：在转移后的处理过程中蛋白质必须保持吸附在印迹膜上
- 处理过程中可接近：被吸附的蛋白质必须能够与检测试剂接触，如果蛋白质被掩盖则无法检测
- 阳性对照：明确表达检测蛋白的组织或细胞，用于检测抗体的工作效率
- 阴性对照：明确不表达检测蛋白组织或细胞，用于检测抗体的特异性
- 二抗对照：不加一抗，用于检测二抗的特异性
- 内参对照：检测标本的质量和二抗系统
- 空白对照：不加一抗和二抗；用于检测膜的性质和封闭的效果
1、获取细胞或组织裂解物
1)根据检测蛋白的位置选择合适的裂解buffer：
| 蛋白位置 | 推荐buffer |
| 全细胞 | NP-40 or RIPA |
| 胞浆（可溶性蛋白） | Tris-HCl |
| 胞浆（骨架结合蛋白） | Tris-Triton |
| 膜蛋白 | NP-40 or RIPA |
| 核蛋白 | RIPA or 核蛋白提取试剂盒 |
| 线粒体蛋白 | RIPA or 线粒体分离试剂盒 |
2)选择合适的蛋白酶抑制剂，避免蛋白降解，从而保证检测的准确性！
2、蛋白定量
常用的蛋白定量方法：Bradford assay, Lowry assay 或BCA assay。定量后，可根据情况将标本保存在-20°C /-80°C备用，进行免疫沉淀（IP）或者直接进行电泳分离蛋白
3、电泳分离蛋白质
根据待测蛋白状态确定电泳条件：
| 待测蛋白状态 | 凝胶条件 | 上样buffer | 电泳buffer |
| Reduced - Denatured | 还原，变性 | 含β-巯基乙醇或DTT，含SDS | 含SDS |
| Reduced - Native | 还原，不变性 | 含β-巯基乙醇或DTT，不含SDS | 不含SDS |
| Oxidized - Denatured | 不还原，变性 | 不含β-巯基乙醇或DTT，含SDS | 含SDS |
| Oxidized - Native | 不还原，不变性 | 不含β-巯基乙醇或DTT，不含SDS | 不含SDS |
| 蛋白分子量（kDa） | 凝胶浓度（％） |
| 4-40 | 20 |
| 12-45 | 15 |
| 10-70 | 12.5 |
| 15-100 | 10 |
| 25-200 | 8 |
根据不同的检测目的和待测蛋白的特性，选择合适的膜类型。常用的转移膜类型有：PVDF膜、硝酸纤维素膜（NC膜）和尼龙膜，其中PVDF和NC膜的使用频率最高。各种膜的技术参数及比较如下：
| PVDF膜 | NC膜 | 尼龙膜 | |
| 灵敏度和分辨率 | 高 | 高 | 高 |
| 背景 | 低 | 低 | 较高 |
| 蛋白结合能力 | 100-200ug/cm2（适用于SDS存在时与蛋白结合） | 80-100ug/cm2 | >400ug/cm2 |
| 机械强度 | 强 | 干的膜易脆 | 软而结实 |
| 溶剂抗性 | 强 | 差 | 差 |
| 使用前是否需要浸润 | 100%甲醛润湿 | 缓冲液润湿 | 缓冲液润湿 |
| 适用染色方法 | 胶体金、丽春红、酰胺黑、印度墨汁、考马斯亮兰 | 胶体金、丽春红、酰胺黑、印度墨汁 | 不能用阴离子染料 |
| 适用检测方法 | 显色法、化学发光、荧光、放射性、化学荧光、快速免疫检测 | 显色法、化学发光、荧光、放射性 | 显色、化学发光、放射性 |
| 适用范围 | 普通蛋白WB、糖蛋白检测、蛋白质测序、氨基酸分析、重复检测 | 普通蛋白WB、氨基酸分析、重复检测。0.1um膜适用于7kDa以下蛋白 | 低浓度小分子蛋白、酸性蛋白、糖蛋白、蛋白多糖、核酸检测常用 |
| 价格 | 高 | 较低 | 低 |
去掉膜上多余的非特异性结合位点，降低背景。常用的封闭溶液有：含BSA或者脱脂奶粉的TBST或TBS
6、一抗孵育
一抗的选择成功与否，是整个WB实验成功的关键：选择一抗有以下几个注意点：
- 选择适合检测标本种属的一抗（说明书有验证）
- 选择适用于WB实验方法的一抗（说明书有验证）
- 选择单克隆抗体或者经过亲和纯化的多克隆抗体
- 根据说明书的要求条件进行抗体的保存；一般需要将抗体分装后放入-20度保存，绝对避免反复冻融。
- 抗体的工作液最好现配现用，在4度保存最好不要超过2周
- 根据说明书推荐浓度使用TBST稀释一抗。由于实验室条件和检测方法等的差异，说明书推荐的稀释比例只作参考，需要在说明书推荐的浓度周边进行多个浓度梯度的实验检测，然后选择信噪比最好的抗体浓度进行实验。如果说明书没有推荐浓度，可进行多个稀释比例进行摸索最佳稀释度（1:100-1:3000）。
- 孵育条件：推荐4°C孵育过夜（一般大于18个小时），根据抗体亲和力不同孵育时间有所区别
WB常用内参及其技术参数：
| 内参名称 | 分子量大小 | 适用范围 |
| beta-actin | 43kDa | 胞浆和全细胞 |
| GAPDH | 30-40kDa | 胞浆和全细胞 |
| Tubulin | 55kDa | 胞浆和全细胞 |
| VCDA1/Porin | 31kDa | 线粒体 |
| COXIV | 16kDa | 线粒体 |
| TBP | 38kDa | 细胞核 |
根据说明书推荐浓度使用TBST稀释一抗。如果说明书没有推荐浓度，可进行多个稀释比例进行摸索最佳稀释度（1:1000-1:20000）。孵育条件一般为室温1-2小时
8、底物孵育
选择显色或者化学发光底物。一般倾向于化学发光，灵敏度高且背景低，节省抗体用量
9、结果分析和检测
凝胶成像系统检测或者暗室曝光到胶片
Note：从封闭开始，每步之间都需要用TBST进行洗涤，3次，每次5min
上海维景生物科技有限公司是一家专注生命科学领域的企业，借助中科院细胞与免疫学实验平台，拥有强大的资金背景支持和专业的团队等资源。公司面向全国市场，迅速发展，广纳英才，现已建成专业生命科学产品销售团队，其中大部份是在生命科学市场上工作多年，有丰富的销售经验，也有良好的客户资源，销售渠道全面覆盖华东大部分工业以及科研客户，团队中免疫学及相关专业硕士以上学历人士达50%，有较强的技术支持能力，在针对专业技术服务中能够提供完善周到的专业化服务，对客户在使用产品过程中提出的问题能满意答复，并可及时传递最新的产品技术资料信息。
上海维景生物科技有限公司凭借优质的技术服务平台和专业的技术服务团队，维景生物倾情打造最高质量的技术服务。至今，已为广大科研客户和合作伙伴提供了实时定量PCR、细胞凋亡、Western-blot 、Elisa 、免疫组化、原位杂交、质粒载体的构建、稳定细胞系的筛选、siRNA干扰效率的鉴定、双萤光报告系统、蛋白表达及纯化、腺病毒/ 腺相关病毒/ 慢病毒的包装服务、单多克隆抗体的制备、SCI文章的修改及发表服务等。
生物实验技术服务项目列表
预实验免费！常用抗体免费！
分子克隆技术服务：载体构建、定点突变、RT-PCR、荧光定量PCR、SNP分型等；
蛋白免疫学实验服务：Western Blot检测、免疫组化检测、流式检测与分选，细胞凋亡检测与分析、抗体制备等。
细胞生物学技术服务：细胞培养、原代培养、细胞株构建、三维培养、病毒包装（慢病毒、逆转录和腺病毒）、细胞分选与培养、细胞侵袭与催化、共聚焦检测等技术
