服务名称: | 单链构象多态性分析服务 (SSCP) |
提供商: | 云南临康生物 |
规格: | PCR-电泳-银染 |
实验流程:
1、基因组抽提与质检;
2、PCR扩增靶DNA;
3、将特异的PCR扩增产物变性,使之成为具有一定空间结构的单链DNA分子 ;
4、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳;
5、银染显色;
6、结果分析与报告。
样品要求:
1、组织样本:-20℃或-80℃低温冰箱中保存,液氮或者干冰运输。若提供的材料为新鲜组织、血液细胞等生物材料,请提供足够提取2ug以上基因DNA的材料量;
2、DNA样本:体积≥20ul,浓度≥100ng/ul,DNA总量≥2ug,20℃保存,低温冰袋运输;
3、血液样本:要求保存于抗凝管中或冻存管中,体积大于2ml,请用干冰运送,保证DNA不降解;
4、样品为石蜡包埋组织切片的,要求提供10张组织切片光片(面积>10mm×10mm,厚度约5-10um);
服务说明:
1、核酸片段的大小:用于SSCP分析的核酸片段越小,检测的敏感性越高。对于<200 bp的片段,SSCP可发现其中70%的变异;对于300 bp左右的片段则只能发现其中50%的变异;而>500 bp的片段,则仅能检出10%~30%的变异,因此,<300bp,尤其是150 bp左右的核酸片段更适于SSCP分析。对于大于400bp的PCR产物就需要设法进一步处理,可以用限制性酶消化PCR产物,产生小于400 bp的DNA片段,再进行SSCP分析;
2、游离引物: 游离引物可能同PCR产物结合而改变其泳动率,即使游离引物量为6 nM都有明显影响。因此,应尽可能除去游离引物。可以采用不对称引物扩增方法,尽可能消耗多余的引物。也可以运用过柱或磁性球方法纯化PCR产物。或者是稀释PCR产物,减少游离引物的干扰;
3、假阴性: 一般认为,如没有污染,PCR-SSCP分析不存在假阳性结果,但可能出现假阴性结果,后者是由于点突变引起的空间构象变化甚微,迁移率相差无几所致,尤其是点突变发生在扩增片段的两端时。如果有阳性和阴性对照,结果可以重复确定的突变带是可信的,如果没有阳性对照,应经测序来确定其是否为突变带。由于PCR-SSCP的不足之处主要是可能检出假阴性结果。应通过设置阳性对照,摸索电泳条件,假阴性结果在很大程度上是可以避免的。但对未知基因变异的检测,假阴性结果则难以完全消除。
我们提供:
1、合成的引物;
2、电泳图谱;
3、实验报告。