提供商: | 云南临康生物 |
服务名称: | 随机扩增多态性DNA(RAPD)分析服务 |
试剂、试剂盒:寡核苷酸引物、dNTPs、Taq DNA聚合酶、PCR缓冲液、矿物油、电泳所需试剂
仪器、耗材:PCR仪、电泳装置、微量离心机、微量移液器、Eppendorf管、凝胶成像系统
一、 实验条件
1. 药品试剂
(1)模板DNA(10~100 ng)
(2)寡核苷酸引物(20 mmol/L贮存液,可向Operon Technologies或Perkin Elmer公司购买,也可以自己合成)
(3)0.2 mmol/L dNTPs(必须使用高质量的dNTPs,这一点非常重要。dNTPs经反复化冻后会发生降解,因此应分成小份保存。应注意混合物中四种dNTP的量要相等)
(4)Taq DNA聚合酶(Perkin Elmer,Norwalk,Connecticut)
(5)10×PCR缓冲液(500 mmol/L KCl,15 mmol/L MgCl2,100 mmol/L Tris HCl,pH 8.3)
(6)矿物油
(7)电泳所需试剂
2. 仪器设备
PCR扩增仪、电泳装置、微量离心机、微量移液器(1~20 ml和20~200 ml)、0.5 ml Eppendorf管、紫外线观察装置及照相设备。
二、 操作程序
1. 在冰里向无菌的Eppendorf管中加入以下反应物:
水: 14.75 ml
10×缓冲液: 2 ml
10×dNTPs:2 ml
引物(20 mmol/L):0.2 ml
Taq DNA聚合酶
终体积
DNA(10~100ng):1 ml
石蜡油 :20 ml
2. 93℃反应2 min后开始如下循环:
93℃变性反应:1 min
36℃退火反应:1 min
72℃延伸反应:1.5 min
经过45个循环后,最后一个循环72℃增加5 min,循环结束后反应产物置于4℃保存。
3. 20 ml反应产物走凝胶电泳,经溴化乙锭染色检测扩增的情况。