提供商: | 莱博生物 |
服务名称: | 凝胶迁移或电泳迁移率实验 |
规格: | 每位点 |
1) 非变性电泳:30%丙稀酸胺2.66 ml,TBE(5X)2 ml,10%过硫酸按1.4 ml,TEMED7 ul,双蒸水补足20 ml。按照上述配方配置4%的非变性胶。在烧杯中迅速混匀,置于冰上,灌胶,待凝胶聚合后拔出梳子,用双蒸水洗点样孔,再用0.5xTBE清洗点样孔。
2) 样品准备:按照不同的组合加入DNA和蛋白,另外还需要加入结合缓冲液,如果是粗蛋白还需要加入poly(dI.dC)(试剂盒中有)抑制非特异性条带的产生。
3) 电泳:预跑胶30-60 min,100 V。上样。跑胶,100 V,30 min左右。注意电泳要在冰上完成,以防止电泳时产生热量使不稳定的复合物解离。
4) 转膜:电泳跑好后,将胶取下,放在大小相似的尼龙膜上,上下各加一层润湿的blotting paper,放到半干转移装置上,100 V,380 mA,转膜1 h。
5) UV交联:取出膜。在紫外交联仪中999.9 mJ,固定10 min。
6) 洗膜:
a. 将Blocking Buffer和4XWash Buffer置于37-50℃使其溶解。
b. 用20 ml of Blocking Buffer封闭膜,温浴15 min,摇床轻摇。
c. 在20 ml Blocking Buffer中加入66.7 ul Stabilized Streptavidin-Horseradish Peroxidase Conjugate(1:300稀释),配置成conjugate/blocking solution。
d. 将膜从blocking buffer中取出,在conjugate/blocking solution中轻摇15 min。
e. 将4XWash Buffer用双蒸水稀释成1 Xwash solution。
f. 将膜置于新的培养皿,用20 ml 1 Xwash solution冲洗。
g. 用1 Xwash solution洗膜4次,每次5 min,摇床轻摇。
h.在新培养皿中加入30 ml Substrate Equilibration Buffer,将膜放入,温浴5 min,摇床轻摇。
i. 将6 ml Luminol/Enhancer Solution和6 ml Stable Peroxide Solution避光置于锡箔纸包好的烧杯中,摇匀,作为Substrate Working Solution。
j. 将膜从Substrate Equilibration Buffer中取出,用滤纸尽量吸去液体,放入新的培养皿。
k. 将Substrate Working Solution用枪慢慢加到膜上使液体尽量到达整张膜,静置5min。
l. 取出膜,控制膜不能干燥。
m. 用保鲜膜将膜包好,不能有气泡。
n. 在暗室中,将膜放入曝光盒,用X-ray胶片压片,曝光时间随温度变化而不同,室温一般1 min。然后将胶片取出,经过显影,水洗和定影可以看到实验结果,如果胶片长期保存一定要在水龙头底下长时间冲洗,晾干后可拍照。
1、客户提供组织、细胞,公司提取核蛋白并进行蛋白浓度测定;
2、客户提供核蛋白,公司进行蛋白浓度测定;
3、客户提供已知浓度的核蛋白,公司进行EMSA实验。
样品质检报告、实验数据分析、实验方法及样品EMSA电泳图。
收费标准/服务周期/提供结果:
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