RNAi

技术简介

1)技术原理:

RNA干扰（RNA interfering，RNAi）现象是由与靶基因序列同源的双链RNA引发的广泛存在于生物体内的序列特异性基因转录后的沉默过程。由于RNAi具有高度的序列专一性和有效的干扰，可以特异地将基因沉默，从而使基因功能丧失或基因表达量的降低，因此可以作为功能基因组学的一种强有力的研究工具。RNAi技术可广泛应用到包括功能学，药物靶点筛选，细胞信号传导通路分析，疾病治疗等领域。我们应用专利算法和Invitrogen的BLOCK-iT™ RNAi Designer平台，可对靶基因序列进行干扰位置效应评价和序列同源性分析，完成siRNA/shRNA/miRNA等多种序列的设计，并提供从siRNA合成、RNAi载体构建到RNAi相关的病毒包装、RNAi功能验证等全面的RNAi解决方案。

RNAi服务类别：

a. siRNA合成

对于瞬时基因沉默试验，化学合成siRNA的方法操作简便，容易获得高水平的瞬时沉默效果，特异性强。我们通过严格设计来增强siRNA的专一性；针对某靶基因设计的3条siRNA可保证其中两条的Knockdown效率达到70%（在转染效率大于80%的情况下）。

b.  RNAi载体构建

RNAi载体表达可以长时间稳定地研究基因功能，载体在细胞中持续抑制靶基因的表达可达数星期甚至更久。

BLOCK-iT™ miR RNAi载体构建－利用细胞内源性的miRNA加工机制，相比传统shRNA载体可更高效地表达RNA发夹结构，并具有采用EmGFP进行表达追踪和顺式表达多个miRNA的优点。Invitrogen针对人类、大鼠、小鼠的大多数基因预先设计好了BLOCK-iT miR RNAi Select序列，每个基因设计的4条BLOCK-iT miR RNAi Select序列我们保证至少有2条可以达到至少70%转录水平的knockdown（在转染效率>80%的前提下）。

BLOCK-iT™ shRNA载体构建—设计针对特定基因的shRNA序列，并将其连入组成型pENTR™/U6或诱导型pENTR™/H1/TO载体中。

c. RNAi导入优化

由于siRNAs是进入细胞后才能对蛋白的表达进行抑制，因此如何高效地将siRNAs转入细胞也是成功抑制基因表达的关键步骤。例如，一个siRNA分子对某特定基因的抑制效率为90%，而转染效率为10%，那么最后抑制蛋白表达最后的效率只有9%，可见如何提高siRNAs的导入效率非常重要。

RNAi转染优化－为了使得RNAi实验获得最大化的干扰效果，利用Invitrogen专利的脂质体转染试剂技术，针对多种真核生物细胞进行转染参数的优化。RNAi 荧光标记的阴性对照、阳性对照可以用于进行转染效率的优化。

病毒侵染优化－针对难于转染细胞（特别是神经细胞、悬浮细胞、干细胞）和In vivo实验，基于Invitrogen的RNAi病毒载体构建、包装、浓缩等技术，利用腺病毒或慢病毒进行RNAi研究

筛选RNAi稳定细胞株－利用抗生素来筛选稳定表达shRNA或miRNA的细胞株

d. RNAi干扰效果检测

用实时定量PCR方法检测mRNA水平的基因敲减效果；通过Western blot方法检测蛋白水平的基因敲减效果

2）特点：

1. 高效性：Elbashir等在研究中发现分别为25 nmol/L与100 nmol/L的起始双链RNA产生的结果是一样的，只是高浓度起始的更有效些。将双链RNA浓度降低到1.5 nmol/L时产生的基因沉默效果变化不大，只有当浓度降低到0.05 nmol/L时，沉默的效果才消失。Holen等也证实1～100 nmol/L的双链RNA浓度对基因沉默的效果是一致的。这说明双链RNA介导的基因沉默效率是相当高的。需要ATP：Zamore等认为RNAi过程中至少有2个步骤需要能量的供给：一是长的双链RNA被 Dicer所酶切产生双链RNA；二是在双链RNA与RISC结合解链后形成有活性的RISC。

⒉特异性：Elbashir等和Brummel kamp等发现在21～23个碱基对中有1～2个碱基错配会大大降低对靶mRNA的降解效果。

⒊位置效应：Holen等根据人TF(tissue factor）不同的位置各合成了4组双链RNA来检测不同位置的双链RNA对基因沉默效率的影响。在不同浓度和不同类型的细胞中，hTF167i和hTF372i能够抑制85%～90%的基因活性，hTF562i只能抑制部分基因活性，而hTF478i则几乎没有抑制基因的活性。他们还以hTF167为中心依次相差3个碱基对在其左右各合成了几组双链RNA，有趣的是它们所能抑制该基因活性的能力以hTF167为中心依次递减。特别是hTF158i和 hTF161i只与hTF167i相距9个和6个碱基，但它们几乎没有抑制该基因活性的能力。结果还表明双链RNA对mRNA的结合部位有碱基偏好性，相对而言，GC含量较低的mRNA被沉默效果较好。

⒋竞争效应：Hoten等将10 nmol/L和30 nmol/L的hTF167i相比，两者的沉默基因效果无差异，但将20 nmol/L基因抑制效果很差的PSK314i和10 nmol/L的hTF167i相混和后，hTF167i产生的抑制效果明显降低。

⒌可传播性：在线虫中，双链RNA可以从起始位置传播到远的地方，甚至于全身。Feinberg 和Hunter在线虫细胞膜上发现一种跨膜蛋白SID1，它可以将双链RNA转运出细胞，因此系统性的RNAi包括了SID1介导的双链 RNA在细胞间的运输。但在果蝇上并未发现有此基因的同源物，因此在果蝇上通过注射产生的RNAi不能扩散。