质粒转染

1)技术原理:

转染类型：根据不同的实验目的，外源DNA导入哺乳动物细胞又可分为瞬时转染和稳定转染。

瞬时转染一般是指外源基因进入受体细胞后，存在于游离的载体上，不整合到染色体，在外源DNA导入细胞1—4天后收获转染细胞对转染基因的转录和复制进行分析。

而稳定转染则需要使外源基因整合于细胞染色体从而得到稳定的转染细胞株。实现细胞的稳定转染，通常需要一个抗生素筛选的过程。

除DEAE葡聚糖只能用于瞬时转染，其他方法均可用于瞬时转染和稳定转染。

质粒转染是指将外源分子如DNA，RNA等导入真核细胞的技术。随着分子生物学和细胞生物学研究的不断发展，转染已经成为研究和控制真核细胞基因功能的常规工具。在研究基因功能、调控基因表达、突变分析和蛋白质生产等生物学试验中，其应用越来越广泛。

因为不同的细胞在生理代谢及分裂上均存在差异，因此研究者将外源遗传物质导入细胞的过程中需要选择不同的方式。目前，将外源物质导入细胞的方法主要分为三大类：1、脂质体（或是脂质体替代物）转染；2、电转；3、病毒感染。这三种方法互有优劣。脂质体或是脂质体替代物转染操作简便，价格低廉，但是对细胞毒性大。而且，有些细胞通过脂质体转染效率很低；电转操作方便快捷，但是需要专门的仪器，对细胞损伤也比较大；病毒感染克服了前两者的劣势，感染效率高，对细胞毒性小，但是病毒前期包装需要大量的时间和精力 。

2）实验步骤：

1. 转染试剂的准备

① 将400ul去核酸酶水加入管中，震荡10秒钟，溶解脂状物。

② 震荡后将试剂放在－20摄氏度保存，使用前还需震荡。

2. 选择合适的混合比例(1：1－1：2/脂质体[1] 体积：DNA质量)来转染细胞。在一个转染管中加入合适体积的无血清培养基。加入合适质量的MyoD或者EGFP的DNA，震荡后在加入合适体积的转染试剂，再次震荡。

3. 将混合液在室温放置10―15分钟。

4. 吸去培养板中的培养基，用PBS或者无血清培养基清洗一次。

5. 加入混合液，将细胞放回培养箱中培养一个小时。

6. 到时后，根据细胞种类决定是否移除混合液，之后加入完全培养基继续培养24－48小时。
3）质粒转染的详细  

脂质体：中性脂质(lipid)是利用脂质膜包裹DNA，借助脂质膜将DNA导入细胞膜内。带正电阳离子脂质体(Cationic liposomes)则不同，DNA并没有预先包埋在脂质体中，而是带负电的DNA自动结合到带正电的脂质体上，形成DNA-阳离子脂质体复合物，据认为一个约5kb的质粒会结合2-4个阳离子脂质体，从而吸附到带负电的细胞膜表面，经过内吞被导入培养的细胞。脂质体转染方法始于1987年，这个方法的出现使得转染效率、转染的稳定性和可重复性大大提高，并广为使用。阳离子脂质体细胞毒性相对较高，对不同的细胞可能会干扰细胞的代谢。血清的存在有可能会影响转染效率，需要进行优化。通常转染试剂有不同脂质（lipid）和脂质体（liposome）混合配方。

非脂质体的脂质（Non-liposomal lipids）：这个读着颇为拗口的新一代技术，代表着脂质体技术的未来发展方向——革新配方成分形成胶束（micellar）结构而非简单的双层膜结构，令核酸传递更有效率而且细胞毒性也显著降低

活化的树状聚合物（Activated dendrimers）：这个确乎是Qiagen的独门配方的Activated dendrimers本来真正属于纳米技术，高度树状分枝形成球形结构有着均一的大小和形状，借助每个球体无数活化的氨基末端凝聚在DNA上形成较为致密的结构，并吸附在细胞膜上，经过内吞进入细胞。活化的氨基可以调节胞内融酶体的pH值，抑制降解活性，使得DNA稳定存在。转染的效率高，毒性低，可重复性好。血清的存在能显著提高转染效率。

多胺和新一代转染介质：多胺其实也是氨基多聚物，原理无非基于吸附带负电的核酸形成非共价结合的复合物，结合并穿越同样带负电的细胞膜。优点是可以携带较大的分子，而且细胞毒性也较低，不会干扰细胞代谢途径。新一代转染介质并不局限于单一成分，各种不同专利配方的脂质、加上蛋白质组分、以及各种各样的专利成分，务求令转染效率更高，操作更方便，细胞毒性更低。还有的产品将脂质偶联到细胞膜特定受体蛋白的配基上，让受体蛋白更有效率地转运DNA或者生物大分子复合物进入细胞……

显微注射和基因枪（Biolistic particle delivery）：显微注射和基因枪是更特殊的导入DNA的方式：将DNA沉淀包被在极为微小的金颗粒（闪闪发光的金珠，gold beads）上，借助高压基因枪将大分子直接“射”入细胞，一旦细胞接受，就会发生瞬时表达——这种方法多用于活体内导入DNA，比如皮肤的DNA免疫。也有用于上皮细胞原代细胞的报告。最新技术是利用硅纳米颗粒作为基因转染载体。
显微注射顾名思义就是使用一根超细针头将DNA，RNA或蛋白直接注入细胞质或细胞核；整合的机会高一些，但适用这种方法的细胞好像不多，体外受精较为常见。这两种方法需要的昂贵设备和相对复杂的技术，令普通实验室敬而远之。

病毒介导的感染：荷马史诗对整个欧美文化的影响内在而深远的。受荷马史诗中的特洛依木马的启发，借助病毒高效感染细胞的机制，将病毒衣壳内的核酸换成克隆的目的基因，就可以将目的基因高效运送到特定的细胞中——整一出“木马计”。感染，是区别于常规转染的另一种将外源基因导入哺乳动物细胞的方法。前面提到的转染是利用某种生化试剂或者物理介质“携带”DNA穿过细胞膜进入细胞，这种相对简单的方法适用于绝大多数培养细胞。感染需要将目的基因克隆到特定的病毒体系中，经过包装细胞的包装得到“经过改造的”病毒，再进行感染－－优点是感染效率特别高，特别是有些难以转染的原代细胞、活体细胞。适用的细胞类型与病毒感染特性有关，常用的病毒体系包括逆转录病毒，可以高效将目的基因整合到染色体上而得到稳定表达，但只适合处于分裂期的细胞，能装载的核酸大小有限；腺病毒可以感染分裂期和非分裂期的细胞，但是不能整合稳定表达，只是游离地瞬时表达；痘病毒能装载大片断DNA又能感染大多数哺乳动物细胞，可是仅限于瞬时表达；杆状病毒受限于只能感染昆虫细胞。总的来说，病毒体系时间长代价高也比较复杂，操作不当还可能有潜在的危险。这个木马可不那么好骑滴。