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蛋白质组学：SILAC 代谢标记定量实验
免疫荧光/IF/激光共聚焦拍片
WB
通过门头沟分局认证 
MassArray（Sequenom
泛素化修饰蛋白质组学
乙酰化修饰蛋白质组学
蛋白激光辅助解析串联
液质联用（QE）（HPLC
WB检测（Western-Blot| 提供商： | 北京青莲百奥生物科技有限公司 |
| 服务名称： | 蛋白质定性定量分析 |
| 规格： | itraq 6000,label-free 3000 |
一、Label-free技术简介
蛋白质非标记定量技术（label-free）是通过液质联用技术对蛋白质酶解肽段进行质谱分析，无需使用昂贵的稳定同位素标签做内部标准，只需分析大规模鉴定蛋白质时所产生的质谱数据，比较不同样品中相应肽段的信号强度，从而对肽段对应的蛋白质进行相对定量。Label-free的技术优势就在于蛋白质不需要进行标记，所需样品总量少，耗费低。
二、技术原理
非标记定量蛋白质组学已成为越来越重要的质谱定量方法，按照其原理主要分为两种： Spectrum counts类的非标记定量方法：发展比较早，已经形成多种定量算法，但主要原理都是以MS2的鉴定结果为定量基础，各种方法的差别在于后期算法在大规模数据上的修正。 另一种非标记定量方法的原理是以MS1为基础，计算每个肽段的信号强度在LC-MS色谱上的面积积分。
三、实验流程
四、应用特点
● 对液相色谱串联质谱的稳定性和重复性要求较高。
●无需昂贵的同位素标签做内部标准，实验耗费低。
●对样本的操作也最少，从而使其最接近原始状态，并且不受样品条件的限制，克服了标记定量技术在对多个样本进行定量方面的缺陷。
| 同位素标记 | 非同位素标记 |
| 样本标记同位素 | 样本非标记 |
| 样本量限制，ICAT（2），iTRAQ（8）等 | 样本无限制 |
| 在大样本过程中，难于跟踪蛋白丰度 | 易跟踪蛋白丰度 |
| 多数肽段难于识别 | 能够识别大多数肽段 |
| 难于识别和定量低丰度蛋白 | 能够鉴别低丰度肽段 |
| 需提前进行二级质谱蛋白鉴定 | 可以鉴定差异后再进行二级质谱蛋白鉴定 |
| 实验重现性高 | 实验重现性低 |
五、信息分析
| 表 | 图 |
| 差异基因列表 | 样本之间相关系数热图 |
| 上下调基因表 | 层次聚类热图 |
| 差异基因数目比较表 | 主成分分析图 |
| 上下调基因数目比较表 | K-均值聚类图 |
| 鉴定蛋白理化性质表 | GO功能富集图 |
| K-均值聚类类别表 | 差异基因火山图 |
| 时间序列的相关系数表 | 差异基因的KEGG通路图 |
| GO功能表（仅限于UNIPROT来源的库） | 网络图 |
| 信号通路Mapping表 | 染色体定位图（若有染色体定位信息） |
信息分析内容
数据产出统计
蛋白质鉴定结果
蛋白质定量结果
蛋白质GO分析
蛋白质COG分析
蛋白质Pathway代谢通路分析
差异蛋白GO富集分析
差异蛋白的Pathway富集分析
重复性分析（仅针对有重复设计的项目）
多样品间表达模式聚类（适用于样本数≥3的项目）
定制化信息分析
蛋白质组与转录组关联分析
六、样本要求
| 样品类型 | 样品要求 |
| 蛋白质提取物 | 浓度 >1μg/μl，蛋白质总量 >200μg |
| 组织样品 | 动物、微生物组织湿重>10mg；植物鲜嫩组织>100mg |
| 体液样品 | 血液体积>500μl |
| 细胞样品 | 细胞量>10的7次方 |
一、iTRAQ技术简介
iTRAQ技术是由美国应用生物系统公司(Applied Biosystems Incorporation，ABI)2004年开发的同重标签标记的相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ)技术。
iTRAQ试剂是可与氨基（包括氨基酸N端及赖氨酸侧链氨基）连接的胺标记同重元素。在一级质谱图中，任何一种iTRAQ试剂标记不同样本中的同一蛋白质表现为相同的质荷比。在一级质谱中，不同来源的相同肽段表现为一个峰；在二级质谱中，iTRAQ试剂中的平衡基团发生中性丢失，信号离子表现为不同质荷比(114～121)的峰，因此根据波峰的高度及面积，可以得到同一蛋白在不同样本中的表达差异；同时，肽段的MS/MS结果结合数据库检索可以鉴定出相应的蛋白种类。
二、技术原理
报告部分共有8种：质量数分别为114~121Da，因此iTRAQ最多可同时标记8组样品（客户可按需选择标记个数）。
肽反应部分：能与肽链N端及赖氨酸侧链发生共价连接，从而将报告部分和平衡部位标记到肽段上，几乎可以标记所有蛋白质。
平衡部分：质量数分别为31~24Da，与报告部分相互配合，保证iTRAQ试剂标记的不同样本的同一肽段具有相同的质荷比。
三、实验流程
iTRAQ实验流程。
1：收集不同组别的样本并分别提取蛋白质；
2：蛋白质经过还原，封闭后用胰蛋白酶酶切；
3：各组样本的肽段混合物分别用不同的iTRAQ试剂标记；
4：等量混合各样本中的标记肽段；
5：MS/MS质谱检测及分析。
四、技术优势
灵敏度高：可检测出低丰度蛋白；
分离能力强:可分离出酸/碱性蛋白，小于10KD或大于200KD的蛋白、难溶性蛋白等；
适用范围广：可以对任何类型的蛋白质进行鉴定，包括膜蛋白、核蛋白和胞外蛋白等。
高通量：可同时对8个样本进行分析，特别适用于采用多种处理方式或来自多个处理时间的样本的差异蛋白分析；
结果可靠：定性与定量同步进行，同时给出每一个组分的相对表达水平、分子量和丰富的结构信息；
自动化程度高：液质连用，自动化操作，分析速度快，分离效果好。
五、信息分析
• 数据产出统计
• 蛋白质鉴定结果
• 蛋白质定量结果
• 蛋白质GO分析
• 蛋白质COG分析
• 蛋白质Pathway代谢通路分析
• 差异蛋白GO富集分析
• 差异蛋白的Pathway富集分析
• 重复性分析（仅针对有重复设计的项目）
• 多样品间表达模式聚类（适用于样本数≥3的项目
也可以根据客户的要求进行个性化定制分析
六、样品准备
1.蛋白运输：24小时内可以4度运输；
2.蛋白长期保存：-20℃；
3.待检测蛋白要求：蛋白量最低50ug，浓度最低要 为5ug/ul 10ul，否则同位素无法标记；
4.蛋白提取试剂要求：使用普通的组织、细胞裂解液即可，切忌不要使用二维电泳试剂提取；
5.直接提供组织或细胞。
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