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35mm培养皿
小鼠冠状动脉平滑肌细胞
生物素定量检测试剂盒（比色法）
[VIP第1年] 指数:2
通过松江区市场监管局认证 
生长激素释放抑制因子| 货号： | L493 |
| 生长状态： | 贴壁 |
| 年限： | 代数：3-4代 |
| 运输方式： | 常温运输/干冰运输 |
| 器官来源： | 人、大鼠、小鼠等其它动物 |
| 细胞形态： | 贴壁 |
| 免疫类型： | 详见说明书 |
| 物种来源： | 人 |
| 相关疾病： | 具体详细询问公司细胞培养专家 |
| 组织来源： | 人正常肺上皮细胞 |
| 品系： | 具体详细询问公司细胞培养专家 |
| 细胞类型： | 详见说明书 |
| 数量： | 10的6次方个 |
| 规格： | T25瓶/株 |
请仔细阅读本操作说明及相应的细胞说明书。
- 收货
- T25是用T25细胞培养瓶直接发货的形式。收到细胞后，拆开包装T25瓶的自封袋，不拆封口膜，表面喷75%酒精消毒后显微镜观察细胞状态（有条件可以拍下此时细胞照片）。将细胞放入37度培养箱平衡两小时以上，再处理细胞。首先将T25中培养基取出装好备用，如细胞密度高于80%，可以直接消化传代，相反则加入5-6mL培养基放回培养箱继续培养即可。
- 离心管是用15mL离心管发货的方式，只用于悬浮细胞发货。收到细胞后消毒处理及平衡参考上述T25瓶。平衡完成后，离心（1000rpm，3min）收集细胞，弃上清，用新的培养基重悬细胞并接种至培养瓶或皿中，放回培养箱继续培养。
- 血清是用牛血清直接发货的形式，是细胞冻存管加入含有细胞的牛血清的形式。收到细胞后，拆开自封袋，冻存管表面喷75%酒精消毒后，在超净台中打开冻存管，将细胞用1mL枪头轻轻几次以将细胞吹匀，接种至含有预热的培养基的培养瓶或皿中，显微镜下观察细胞是否吹匀，如果没有吹匀，继续吹匀至3-5个细胞一团，放回培养箱继续培养。
- 干冰是用本公司冻存液冻存细胞后，直接用干冰将冻存的细胞冷冻发货的形式。收到细胞后按照细胞复苏的步骤操作即可。
- 如不能在收到细胞后及时操作细胞，T25及离心管发货的细胞可以消毒后在37度过夜，血清发货的细胞可以在室温下静置1-2天（注意不要放冰箱），干冰发货的可以在确认干冰未完全升华时将细胞直接放回液氮或者-80度冰箱，若干冰完全升华，请即刻复苏细胞。
- T25瓶及离心管在培养箱平衡是为了让细胞尽快适应培养箱环境，同时使部分因运输导致脱落的细胞贴壁，此步骤非常必要。T25瓶如果在显微镜下可以看到部分不贴壁的细胞，可以收集上清后离心（1200rpm，5min）后，将沉淀用新的培养基重悬后接种至新的培养瓶或皿中。
- 部分细胞在运输过程中，由于不断震荡及环境不适，可能导致细胞破碎死亡，从而使培养基中漂浮很多细胞碎片及颗粒状物质。这种情况下，平衡后，贴壁细胞用PBS洗两遍在加新的培养基培养或者传代至新瓶中培养即可；悬浮细胞可以离心（1000rpm，3min）收集细胞，并用PBS重悬后再离心一次，再用新的培养基重悬并接种细胞。
- 细胞培养及传代
- 细胞请于细胞培养箱中培养，大部分细胞是37℃，5% CO2，湿度100%环境下培养的。有极少部分细胞培养条件不一致，请仔细阅读相应的细胞说明书，使用正确的培养基及培养条件；
- 细胞于培养瓶或皿中培养，加入适量说明书上标注的细胞相应完全培养基（一般液面高度2-3mm即可）。
- 细胞培养至密度达80%以上时即可传代，先将细胞培养基取出3mL用15mL离心管装好，其他培养基全部吸干舍弃；
- 培养皿加入2-3mL无菌PBS，轻轻晃动皿，使PBS浸洗到皿底所有部位，PBS吸干舍弃；
- 加入1mL胰酶，轻轻晃动皿，使胰酶浸没到皿底所有部位，将皿盖好放入培养箱中消化；
- 若细胞还是贴壁，放回培养箱继续消化至不贴壁为止；
- 将细胞悬液均匀分成几份，分别加入不同培养皿中，补加新培养基后放回培养箱培养。
- 部分细胞在传代后时，会有以下现象：细胞内会有黑色小点、细胞间隙有些颗粒物、培养基漂浮一些死细胞或者细胞长的极慢。出现以上现象时，可以咨询本公司技术人员此现象是否正常及相关处理方式，不要频繁换液，大多数细胞1周换液2-3次即可。
- 细胞碎片较多、背景较脏时，贴壁细胞用PBS漂洗两次、悬浮细胞打散后低速离心（900rpm，3min）能有效改善。
- 传代比例建议1:2-1:3，长得比较快的细胞可以1：3，比较慢的按1:2传代。传代后，建议不要使用传代前培养所使用的培养基，会有大量细胞碎片甚至导致细胞死亡的风险。
- 细胞状态不好或者生长极慢的时候，可以通过增加血清浓度调整细胞状态及生长速度。
- 请不要随意更换培养基，因实验需要，可以逐步驯化。
- 细胞冻存
- 冻存液配方：建议使用92%FBS+8%DMSO，客户自身实验室所使用的冻存液也可以适用，血清浓度不低于30%，DMSO含量不高于12%即可。
- 收集细胞按照以上细胞传代步骤操作至第④步后，将细胞悬液收集入15mL离心管，离心（1200rpm，3min）；
- 弃上清，加入配制好的冻存液，重悬细胞，悬液加入无菌冻存管中；
- 将冻存管在4℃静置10min，后将之正置于室温下的厚壁有盖泡沫盒中，盖紧盒盖，放入-80℃冰箱过夜，第二天放入液氮即可长期保存。
- 10cm皿的细胞长满一般可以冻存2-3管，部分细胞长的比较慢，冻存的细胞密度要稍微大点，以防止复苏后生长困难。
- 冻存液中含的DMSO请使用细胞级DMSO，同时浓度不要太高。部分细胞在10%DMSO条件下冻存会死亡，所以DMSO浓度5%-8%是比较推荐的浓度。
- 细胞冻存及复苏遵循慢冻快融的原则，即冻存时温度不能急剧下降，应控制温度缓慢下降。复苏时应快速融化，融化后尽快加入培养基中。
- 冻存时建议设置冻存检测，即取0.2-0.3mL的冻存液重悬的细胞于一个冻存管中，与正常体积冻存的细胞共同冻存，至液氮后复苏检查冻存结果。冻检合格前，留一部分细胞继续培养，以防万一。
- 细胞复苏
- 将冻存细胞从液氮中取出后迅速放入37℃温水中摇晃融化，时间1min左右；
- 于1000rpm离心1min，弃冻存液，加入1mL新的完全培养基重悬细胞；
- 接种至新培养瓶或皿中，补加足量完全培养基，放入培养箱中培养。
- 复苏过程应迅速操作，时间不能太长。
- 复苏过程中注意污染，小心操作。
细胞培养需要耐心与细心，希望您能获得一个满意结果！
