货号: | 10-P1619-1 |
浓度: | 1mg/ml |
应用范围: | 科学研究 |
宿主: | Rabbit |
适应物种: | Human,Mouse,Rat,Chicken,Dog,Cow,Rabbit,Sheep |
标记物: | PE HRP Gold Cy5.5 Cy7 RBITC PE-CY5.5 PE-CY7 APC FITC Cy3 Cy5 |
克隆性: | Polyclonal |
保存条件: | -20℃ |
形态: | 液态/冻干粉 |
亚型: | IgG |
免疫原: | KLH conjugated synthetic peptide derived from human/mouse/Rat |
规格: | 200 ul |
一,动物的免疫
选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功,获得高质量的McAb至关重要。一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫,免疫方案应根据抗原的特性不同而定。
1. 颗粒性抗原免疫性较强,不加佐剂就可获得很好的免疫效果。下面以细胞性抗原为例的免疫方案:
2. 可溶性抗原免疫原性弱,一般要加佐剂,常用佐剂:福氏完全佐剂,福氏不完全佐剂。要求抗原和佐剂等体积混合在一起,研磨成油包水的乳糜状,放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态。商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇,使沉淀的分枝杆菌充分混匀。
初次免疫 Ag 1~50μg 加福氏完全佐剂皮下多点注射
│ (一般0.8~1ml 0.2ml/点)
↓3周后
第二次免疫 剂量同上,加福氏不完全佐剂皮下或ip
│ (ip剂量不宜超过0.5ml)
↓3周后
第三次免疫 剂量同上,不加佐剂,ip
│ (5~7天后采血测其效价,检测免疫效果)
↓2~3周后
加强免疫,剂量50~500μg为宜,ip或iv
↓3天后
取脾融合
目前,用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新,如①将可溶性抗原颗粒化或固相化,一方面增强了抗原的免疫原性,另一方面可降低抗原的使用量。②改变抗原注入的途径,基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂,提高机体的免疫应答水平,促进免疫细胞对抗原反应性。
二,融合与筛选
最重要的一步是融合,我想这也是单抗制备过程中最难的一步了。
(一) 细胞融合流程
1 取对数生长的骨髓瘤细胞SP2/0,1000rpm离心5分钟,弃上清,用不完全培养液混悬细胞后计数,取所需的细胞数,用不完全培养液洗涤2次。
2 同时制备免疫脾细胞悬液,用不完全培养液洗涤2次。
3 将骨髓瘤细胞与脾细胞按1∶10或1∶5的比例混合在一起,在50ml塑料离心管内用不完全培养液洗1次,1200rpm,8分钟。
4 弃上清,用滴管吸净残留液体,以免影响PEG的浓度。
5 轻轻弹击离心管底,使细胞沉淀略加松动。
6 在室温下融合:
①30秒内加入预热的1ml45%PEG(Merek,分子量4000)含5%DMSO,边加边搅拌。
② 作用90秒钟,若冬天室温较低时可延长至120秒钟。
③ 加预热的不完全培养液,终止PEG作用,每隔2分钟分别加入1ml,2ml,3ml,4ml,5ml和10ml。
7 离心,800rpm,6分钟。
8 弃上清,先用6ml左右20%小牛血清RPMI1640轻轻混悬,切记不能用力吹打,以免使融合在一起的细胞散开。
9 根据所用96孔培养板的数量,补加完全培养液,10ml一块96孔板。
10 将融合后细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔板,100μl/孔,37℃、5%CO2孵箱培养。
一般一块96孔板含有1×107脾细胞。
三、抗体的鉴定
筛选杂交瘤细胞通过选择性培养而获得杂交细胞系中,仅少数能分泌针对免疫原的特异性抗体。一般在杂交瘤细胞布满孔底1/10面