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猪外周血白细胞分离液试剂盒
Fastfilter Plasmid Maxi Kit(5)
DNA片段筛选纯化磁珠
[VIP第1年] 指数:2
通过海淀分局认证 
硅胶膜型基因组DNA提
硅胶膜型PCR产物纯化
树脂型基因组DNA提纯
2 x Taq PCR MasterMi
DEPC处理水（DEPC-tre| 货号： | CSA2-50 |
| 数量： | 大量 |
| 供应商： | 赛百盛 |
| 保存条件： | 4℃保存 |
SiMax II质粒DNA小量提取试剂盒使用说明
概 述
本实验方法的基本原理是，在高盐状态下，硅胶膜专一性地吸附DNA；而在低盐或水溶液状态下，DNA被洗脱下来。此法简便快捷，可在30分钟内同时提纯二十多个样品。从3～5ml培养过夜的含高拷贝质粒的菌液中可以获得10～20µg高纯度的质粒DNA，用于酶切、转化、DNA自动测序和手工测序等。试剂盒包装及组成
50次- 悬浮液(溶液I) 7ml
- 裂解液(溶液II) 10ml
- 中和液(溶液III) 10ml
- 结合液 25ml
- 洗脱液 2.5ml
- 离心纯化柱B 50套
- 产品说明书 1份
实验前注意事项
※溶液I最好于4℃保存，使用前移至室温，待试剂温度达到室温后再使用；其它试剂于室温保存。※室温低于25℃时，溶液可能出现结晶或盐析，此时请务必预热，使其完全溶解后使用。
用户自备的仪器及试剂
- 台式高速离心机
- 1.5ml或2ml林习惯及离心管架
- 100ul、1000ul移液器及吸头
- 80%异丙醇或80%乙醇
操作方法
1. 将3～5ml菌液13,000rpm离心30秒收集沉淀（菌体）。如果用1.5ml或2ml离心管则需反复离心2～3次。
2. 倒掉上清，将沉淀（菌体）完全悬浮于100µl悬浮液(溶液I)中。
上清要尽可能去除干净，可用滤纸吸干。沉淀要用混旋器完全悬浮，否则将直接导致下一步的裂解不彻底，进而影响质粒DNA的产量和纯度。
3. 加入150µl裂解液(溶液II)，轻柔地颠倒混匀10次左右，溶液逐渐变得
粘稠、清亮。
不可用混旋器剧烈振荡，否则会使质粒DNA断裂；裂解时间不宜超过5分钟，否则会造成染色体DNA的污染。
4. 加入150µl中和液(溶液III)，轻柔地颠倒混匀10次左右。
此时可见到白色絮状的染色体DNA及细菌碎片。
5. 13,000 rpm离心8～10分钟，将上清液小心转移入一个新的1.5ml离心管中，加入等体积(约400µl)的结合液，颠倒混匀。
6. 将混和液吸入离心纯化柱中，静置至少3分钟，13,000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液。
此步使处于高盐状态下的质粒DNA与硅胶膜结合后，离心去除杂质。
7. 将纯化柱重新套入废液收集管中，加入600µl 80%异丙醇(或80%乙醇)，13,000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液。
如果纯化柱底部残留有异丙醇（或乙醇），可用滤纸吸干，否则将影响以后的酶促反应。此步是洗涤质粒DNA中混有的杂质及盐类。
8. 重复第7步一次，尽可能将杂质及残留的异丙醇或乙醇去除。
9. 取出纯化柱，将其套入一个干净的1.5ml离心管，开盖放置2~3分钟，使乙醇充分挥发干净。加入50µl 洗脱液（若用于测序，则加50µl超纯水）于硅胶膜上，不能粘在管壁上。室温下放置5分钟后，13,000rpm离心1分钟。
离心柱放入离心管中，若盖不上盖子，亦没有关系，可开盖离心。洗脱液或无菌超纯水的用量视用户对浓度的要求而定，但超纯水的洗脱效率不如专门的洗脱液。
10. 将洗脱液重新吸入纯化柱中，再洗脱一次。这样可以获得较高产量的质粒DNA。
11. 离心管中收集的液体即是洗脱下来的质粒DNA，取1～2µl电泳（0.8%琼脂糖，120V，15～20分钟）检测其纯度并目测定量。
若发现有RNA污染，可加入0.5µl RNaseA (10mg/ml)，37℃保温30分钟。此操作不影响其后续实验。
补充说明
※如果起始菌液体积较大或收集的菌体较多，溶液I、II、III的用量及其它试剂可相应放大。但操作略有不同，需要时我们乐于提供帮助。※实验证明，少量的RNA污染对于酶切、转化及测序无明显的影响。
常见问题及参考意见
| 常见问题 | 可能原因 | 参考意见 | |
| 质粒产量低 | 细胞裂解不充分 | 减少培养物体积。对于高拷贝质粒，培养物体积不要超过5ml，低拷贝质粒培养物体积不要超过10ml | |
| 按比例增加溶液I与溶液II的体积，使菌体充分悬浮，然后完全裂解细胞 | |||
| 非转化细胞的大量生长 | 必须在选择条件下扩增质粒DNA | ||
| 定量不准确 | 通过琼脂糖凝胶电泳进行观察及定量 | ||
| 不合适的保存条件 | 将质粒DNA溶于无菌超纯水或TE中，于-20℃保存 | ||
| 菌液培养的时间过长 | 在新鲜的选择平板上挑选一个分隔良好的单菌落，于37℃振荡培养12～16小时 | ||
| 质粒的拷贝数太低 | 增加培养物体积，但不要超过10ml | ||
| 溶液II及结合液有结晶出现 | 将溶液II及结合液置于37℃温浴30min以上，使结晶完全溶解，且在使用前要充分混匀 | ||
| 洗脱温度过低 | 加入无菌超纯水或者洗脱液浸透硅胶膜后，于37~50℃温育2分钟 | ||
| 洗脱液pH<7.0 | 用TE或pH>7.0的无菌超纯水洗脱 | ||
| 洗脱液中没有质粒DNA | 质粒DNA漂出点样孔 | 增加甘油或蔗糖助沉 | |
| 质粒丢失 | 在新鲜的选择平板上挑选生长良好的单克隆进行细菌培养 | ||
| 对质粒DNA进行重新转化 | |||
| 杂菌污染 | 在选择平板上挑选生长正常的菌落进行摇菌 | ||
| 电泳时质粒呈现额外条带 | 开环质粒DNA及线状质粒DNA的存在 | 加入裂解液后，轻轻混匀，时间不要超过5min | |
| 可能存在缺失突变体 | 有些质粒如cosmids长期保存于E.coli中是不稳定的，在摇菌时应在选择平板上挑选新鲜的，分隔良好的单克隆 | ||
| 电泳时质粒呈现额外条带 | 存在质粒多聚体 | 单酶切后，质粒多聚体酶切为线状质粒DNA,可与染色体DNA的污染相区别 | |
| 存在变性的超螺旋质粒DNA | 加入裂解液(溶液II)后，碱裂解时间不要超过5分钟 |
| RNA污染 | 菌体过量，导致RNaseA相对量不足 | 减少培养菌液的体积 |
| 溶液I放置时间超过6个月 | 于100µl溶液I中加入1µl RNaseA (10mg/ml)或于洗脱液中加入0.5µl RNaseA ，37℃温育30min以上 | |
| 染色体污染 | 混合操作过于剧烈 | 加入溶液II、溶液III之后，轻柔地颠倒混匀，不要剧烈振荡 |
| 裂解时间过长 | 裂解时间不要超过5分钟 | |
| 细菌培养期间，出现细胞裂解 | 菌液的培养时间不要超过12～16小时 | |
| 质粒DNA降解 | 核酸酶的存在 | 更换菌株，有些菌株，例如HB101、TG1、JM100等含有高水平的核酸内切酶活性 |
| 使用灭菌的玻璃及塑料制品 | ||
| 用无菌超纯水或TE洗脱质粒DNA | ||
| 质粒DNA在下游操作过程中出现问题 | 盐的浓度过高 | 用80%乙醇漂洗质粒DNA |
| 增加漂洗次数 | ||
| 缺口质粒DNA的存在 | 减少菌液培养的体积 | |
| 更换菌株，情况可能会变好 | ||
| 蛋白质未去除干净 | 检查菌液体积、培养基、菌株生长状况等 | |
| 增加漂洗液的体积及漂洗次数 | ||
| 残留有有机试剂 | 增加离心时间，将80%乙醇或异丙醇去除干净 |
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温馨提示：不可用于临床治疗。
