Taq DNA 聚合酶（Klenow大片段）

制品说明：
Taq DNA 聚合酶（Klenow大片段）是一种热稳定性，持续性5'→3' DNA 聚合酶。该酶蛋白分子量为94kDa，有5’→3’切口平移功能，无3'→5'校正功能。Taq DSC 2.0的配方中添加了一种新型核酸热启动添加剂，该设计保证了反应液的配制阶段和低温循环反应阶段暂不激活聚合酶。

用途：
·普通PCR和高通量PCR
·引物延伸
·微阵列基因芯片分析
·DHPLC

来源：
E.coli菌株，携带来自Thermophilic organism，Thermus Aquaticus YT-1的Taq DNA Polymerase基因。

酶贮存液：
20 mM Tris-HCl
100 mM NaCl
1.0 mM DTTl
0.1 mM EDTA
稳定剂
50% 甘油
pH 7.5，25°C保存

随酶提供：
10X PCR Buffer

10X PCR Buffer：
100 mM Tris-HCl
500 mM KCl
15 mM MgCl2
pH 8.3，25℃保存

单位定义：
1单位是指在75℃条件下，30分钟内，能使10 nmol dNTPs合成掺入酸性不溶物所用的酶的量。

核酸污染检测
单链核酸外切酶活性：
在50μL反应体系中，10μL酶溶液和11,000 cpm放射性标记的单链DNA底物作用，37℃孵育4小时，溶液中可溶性TCA的释放量小于5.0%。

双链核酸外切酶活性：
在50μL反应体系中，10μL酶溶液和5,000 cpm放射性标记的双链DNA底物作用，37℃孵育4小时，溶液中可溶性TCA的释放量小于0.5%。

核酸内切酶活性：
在50μL反应体系中，10μL酶溶液与0.5μg pBR322 DNA作用，37℃孵育4小时，经琼脂糖凝胶电泳，无肉眼可见的环状切口DNA出现。

E.coli 16s rDNA污染检测：
将5μL酶溶液进行变性，用16s RNA基因位点的寡聚核苷酸引物，进行TaqMan qPCR分析，检测E.coli基因组DNA污染物的存在。根据无模板对照的Ct值和标准曲线的拟和结果，本检测的下限可达到10个拷贝/样品。

PCR指南：
Taq DNA聚合酶是最早，也是最广泛使用的PCR酶。Taq酶适用于小于5kb，复杂性不高的DNA片段的扩增，不需优化即可保持稳定的产率。在使用Taq DSC 2.0 DNA聚合酶进行PCR设计时，请遵循以下指导：

1. DNA模板：虽然PCR模板的高度纯化一般来说没有必要，但是当使用未经纯化或简单纯化的PCR模板时，应注意处理液或化学试剂会影响PCR的过程。应避免模板暴露于紫外灯或接触其他可破坏DNA的试剂，如高离子强度溶液，SDS等表面活性剂，loading-dye和苯酚等。在制备PCR反应液的过程中，为了避免污染，应当在正压环境中操作，并使用含气溶胶屏障的枪头。通常25个循环的PCR反应，可复制104个目标序列，模板的终浓度约为0.1-1 ng/mL 质粒DNA，1-10 μg/mL 基因组DNA。使用低浓度的DNA模板，可以降低非特异性PCR产物的量，而高浓度的DNA模板可以减少循环次数，降低突变率。
2. 引物设计：理想的引物长度是15-30 bp，G+C碱基含量50%，两条引物的退火温度相差不超过3℃。建议使用软件检测引物自身的互补性和发夹结构，一些引物合成公司也可提供此类服务。必须注意，尽管引物5’端可以含有不匹配碱基，但3’端必须与模板严格配对。反应液中引物的最佳浓度是0.1-0.5μM。
3. Mg2+：尽管不同反应液中Mg2+浓度不同，但Mg2+是PCR反应液中不可缺少的组分。通常使用1.5-2.0 μM的Mg2+，高浓度的Mg2+（最高可达5.0 μM）可提高PCR的产量，但同时会降低保真率。相反，低浓度的Mg2+可提高产物的保真率，但同时会降低扩增产量，。需要注意，某些反应组分，尤其是模板DNA和寡核苷酸，可能引入螯合剂，这会降低有效的Mg2+含量，造成PCR反应终止。
4. dNTPs: 虽然高浓度的dNTP可提高PCR产量，尤其是长片段PCR扩增，而低浓度的dNTPs可提高产物的保真率，但通常反应液中dNTPs的终浓度为100-200 μM。在某些应用中，Taq DSC 2.0 DNA Polymerase同样可利用dNTPs类似物deoxy Uridine和deoxy Inosine。
5. Taq DSC 2.0 聚合酶：一般浓度为1U/50μL反应液（20U/mL）。为了提高产量，可适量增加taq酶。Taq DSC 2.0 DNA 聚合酶的延伸速度大约是每分钟1-2000核苷酸，因此每1 kb模板延伸1个循环需要30-60s。延伸温度是68-72℃。由于Taq DSC 2.0 DNA 聚合酶对双链DNA片段有天然的亲和力，可启动自身的热启动功能，因此在延伸反应的起始不需要变性步骤来激活聚合酶。

质量控制分析
单位定义方法：
酶的单位活性是通过2倍连续稀释法测得的。用1X reaction buffer稀释该酶，加入到含10μg 小牛胸腺DNA，25 mM TAPS (pH 9.3)，50 mM KCl，2.0mM MgCl2，1 mM DTT，4mCi/mL 3H-dTTP和100 μM dNTPs的50μL反应体系中，酶的终浓度0.00008~0.01μg/μL。75℃条件下孵育10分钟，冰浴后进行1%的琼脂糖凝胶电泳，然后按照Sambrook and Russell的方法进行分析（Molecular Cloning, v3, 2001, pp. A8.25-A8.26）。

蛋白浓度测定（OD280）：
标准操作下，2.0μL蛋白样品，以2.0mg/ml BSA标准样（Pierce Cat#23209）为阳性对照，产品保存液为空白对照，经Nanodrop ND-1000 分光光度计测定OD280值。3次检测的平均值，根据吸光系数转换为11,380mg/mL，分子量为93,909Da。标准样品的允许误差为±5%。

SDS-PAGE（物理纯度检测）
4-20%的变性Tris-甘氨酸SDS-PAGE凝胶，取2.0μL浓缩酶上样，两侧分别取分辨分子量范围较大的蛋白Marker和2.0μL 100倍稀释的待测酶上样。凝胶电泳后进行染色，并通过比较样品确定酶的纯度。本次实验的验收标准为，当浓缩样品中的污染物条带的总质量不超过稀释样品中的目的条带的蛋白质的质量时，可判定浓缩样品的浓度大于99%。

50μL 反应体系：
以下Mix在冰上配制，两者混匀，置于Thermal Cycler加热至94℃：

2X DNA/Oligonucleotide Master Mix
1.0 μL 10 mM dNTPs
1.0 μL 10 μM Forward Primer
1.0 μL 10 μM Reverse Primer
1.0 μL 500 ng/μL genomic DNA
21 μL Type I Water

2X Enzyme/Buffer Master Mix
5.0 μL 10X PCR Buffer I
0.2 μL 5 U/μL Taq DSC 2.0 DNA Polymerase
19.8 μL Type I Water

推荐贮存条件：
-20℃