线粒体DNA提取试剂盒 一,试剂盒组份 组份 | D0040 (50T) | P0040 (100T) | 细胞裂解液 | 50 mL | 100 mL | 线粒体清洗液 | 25 mL | 50 mL | DNA酶I | 12mg | 22mg | DNA酶反应液 | 6ml | 12ml | 线粒体裂解液 | 10ml | 20ml | 蛋白沉淀液 | 7.5ml | 15ml | 核酸助沉剂 | 0.5ml | 1ml | TE缓冲液 | 15ml | 30ml | 二,保存条件 本试剂盒整体保存于2-8度一年。使用前,在DNA酶I中加入600ul(50T)或者1100ul(100T)的DNA酶反应液,分装后-20度保存。线粒体裂解液使用前常温保存,如有沉淀可37度水浴溶解,不影响使用。 三,说明 线粒体DNA提取的关键是尽可能的去掉核DNA。本试剂盒利用差速离心到比较纯净的线粒体,再利用DNA酶消化裂解缓冲系统等多步骤去掉核DNA,最后得到纯净的线粒体DNA。可用于PCR等对纯度要求较高的实验。 本试剂盒用于从动物细胞或组织中分离出完整而纯化的线粒体。适合于动物软组织(肝或脑组织)和硬组织(肌肉)以及培养细胞线粒体DNA的提取制备。不适合植物及其他标本的提取。 四,操作步骤 准备工作:在DNA酶I中加入600ul(50T)或者1100ul(100T)的DNA酶反应液,适当分装后-20度保存。线粒体裂解液保存于常温,如有沉淀37℃水浴溶解,离心机温度下降到4℃(2-8℃),如无低温离心机,也可以常温离心,并将离心时间为10min的改为5min,但最后所得DNA品质及产量可能会有一定影响。 1. 样本处理 a. 组织匀浆:称取100~200 mg新鲜组织如肝脏、脑、心肌等,PBS或生理盐水冲洗,洗净血水,滤纸吸干,用剪刀剪为碎块放入小容量玻璃匀浆器内。加入1.0 mL冰预冷的Lysis Buffer,0℃冰浴上下研磨组织20次; b. 培养细胞匀浆:消化细胞,PBS洗涤,800 × g 5~10 min离心收集细胞。计数。每次提取需要5 × 107个细胞,加入1.0 mL冰预冷的Lysis Buffer重悬细胞,将细胞悬液转移到小容量玻璃匀浆器内,0℃冰浴研磨30~40次; 2. 将组织或细胞匀浆物转移到离心管,4℃,1000× g 离心5 min; 3. 取上清,加入一新的离心管中,4℃,1000× g 再次离心5 min。 4.取上清,加入一新的离心管中,4℃, 12,000 × g 离心10 min。离心后的上清含胞浆成分,可从中提取胞浆蛋白。将上清转移到新离心管,线粒体沉淀在管底; 5. 在线粒体沉淀中加入0.5 mL Wash Buffer重悬线粒体沉淀,4℃,1000× g 离心5 min; 6.取上清,加入一新的离心管中,4℃, 12,000 × g 离心10 min。弃上清,高纯度的线粒体沉淀在管底; 7. 加入100ul DNA酶反应液重悬线粒体,吹打均匀后,再加入10ul DNA酶I溶液(见准备工作),混匀,37度水浴10min。此步为消化线粒体表面吸付的核DNA。4℃, 12,000 × g 离心5 min。尽可能的弃上清,再加入200ul TE 重悬线粒体沉淀,离心,洗去残留的DNA酶。 8.得到的沉淀,用100ul TE 重悬线粒体沉淀。加入200ul线粒体裂解液,轻轻混匀(不可吹打),放置2min左右,不超过5min,再加入150ul蛋白沉淀液,迅速混匀。4℃, 12,000 × g 离心5 min。此步骤可进一步去除核DNA。 9.取上清,加入一新的离心管中(可选用等体积的酚氯仿异戊醇25:24:1抽提一次,再用氯仿抽提一次,或者直接用氯仿抽提两次,一般来说,此步可省,并不影响后续的PCR),加入0.6倍体积的异丙醇(如无异丙醇,可加入2.5倍体积的乙醇沉淀DNA)及10ul核酸核酸助沉剂,混匀,-20℃沉淀半小时左右(此步可省),4℃, 12,000 × g 离心10 min。 10. 弃上清,再加入1ml 70%乙醇,4℃, 12,000 × g 离心10 min。重复用70%乙醇洗一次。 11. 弃上清后再次离心1min 吸弃上清,开盖凉干约5-10分钟。 12.加入20-30ul TE缓冲液,轻弹管底,37度水浴5分钟,线粒体DNA溶解。 13. 进行DNA电泳检测及-20度保存,进行下步的实验。 四 注意事项: 1. 为保证获得完整及尽可能多的线粒体,匀浆条件要示:第一是全程低温操作。第二是快速。第三,如用条件可将匀浆后的碎片在显微镜下观察。与组织块相比,培养细胞特别是贴壁培养细胞在用玻璃匀浆器匀浆时较难破壁,因而要选用小容量玻璃匀浆器、间隙严密的研杵上下研磨培养细胞。 2.线粒体DNA本身含量很低,如果电泳检测不到,可加大上样量,用更少量的TE溶解沉淀,或者直接进入PCR检测。 2. 以离心力g计算正确的离心速度,不同的离心机可据此精确计算离心速度。 一般低温度心机都有离心力显示,如果没有,可以用以下公式简单的换算。 转速与离心力换算 G=1.11×(10-5)×R×[rpm]2 G为离心力,一般以g(重力加速度)的倍数来表示; [rpm] 2即:转速的平方; R为半径,单位为厘米。 | |