均一化酵母双杂交（酵母单杂交）文库

提供商：	上海海科
服务名称：	均一化酵母双杂交（酵母单杂交）文库

均一化酵母双杂交（酵母单杂交）文库
均一化cDNA文库是克服基因转录水平上巨大差异给文库筛选和分析带来障碍的有效措施，有利于研究基因的表达和序列分析。我们基于双链特异性核酸酶(Duplex-Specific Nuclease, DSN)的先进cDNA文库均一化技术，能减低高丰度表达基因20倍以上，有效富集低丰度表达基因，从而降低冗余率。
1.文库特点
1、可以选择酵母双杂交文库构建或者酵母单杂交文库构建系统上叠加均一化步骤。
2、无需反复杂交过程，均一化程度高；
3、均一化后平均插入片断大小无明显变化；
4、均一化后，减低高丰度表达基因10-100倍。

2.材料要求
组织（大于1g）、细胞（>10⁷）或总RNA (>200ug )，请务必保持样品新鲜，RNA 无任何降解，植物材料应避免过老的组织，尽量用柔嫩部位，以确保文库质量。同时请尽量提供物种基因组背景资料信息，如：基因组大小，基因平均长度，预计表达的基因数量等等。

3.提供结果
1、产物电泳图谱及均一化前后管家基因对比图；
2、文库甘油菌和文库质粒。
3、文库评价数据，包括库容量，插入片段平均长度，重组效率， cDNA完整性评价等；
4、包含实验流程、材料、方法等在内的完整的实验报告。
5、承诺以下指标：
5.1 文库库容量＞1*10^6CFU
5.2 文库平均插入片段＞1200bp
5.3 空载率＜5%
5.4 均一化效率＞20倍(以管家基因检测)

4.服务周期：
得到合格的总RNA后30个工作日

5.我们已经成功构建的cDNA文库涉及如下材料：
动物：人、大鼠、小鼠、猪、牛、蟹、虾、鲫鱼、牡蛎、蛏子、扇贝、蚊子、金钱鱼、多宝鱼、壁虎、昆虫、线虫、原生动物等。涉及组织部位包括肾脏、脑、腮、脾、肠、心脏、肝脏等以及各种培养的细胞。
植物：拟南芥、水稻、棉花、小麦、油菜、地瓜、银杏、茶、槟榔、椰子、木薯、百合、土豆、紫菜、枣、烟草、木荷、松树、杉树、丹参、棉花、西瓜、火龙果、楸树等。涉及组织部位包括整株小苗，不同发育时期的种子、胚、胚乳，不同发育时期的花、雄蕊、雌蕊，不同发育时期的顶端分生组织，叶、根尖、穗等。
微生物：多种细菌、动物病毒等。

更多详细技术资料，请访问我们的官方网站：www.bluehitech.com

六、FAQ
6.1. 如何选择合适的文库构建方法进行建库？
我们是市场上唯一几家可以同时提供3种文库构建方法的公司，这也足以看出我们公司的技术实力。
3种方法的比较如下：

1. Clonetech 的SMART方法，该方法基本是被淘汰的，我们上文有详细的技术比较，其唯一的好处就是RNA的起始量可以很小，一般只需要几ug即可，该方法成本很低，一般不建议选择。
2.  Invitrogen的方法，该方法质量上较SMART方法要好很多，其对试剂的质量要求也很高，必须全部使用invitrogen的原厂试剂。我们全部使用invitrogen公司试剂进行构建，且做了一些技术改进，提高了文库质量。该方法对起始的RNA要求较高，建议起始用量是大于200ug。但该方法有一个严重的缺点，就是需要进行两次重组才能得到酵母文库，而多一次重组就会多一次文库扩增过程，会严重影响文库质量。在上文中有详细的技术比较和介绍。

别的使用该方法建库的公司，只能完全使用商业化的试剂盒构建文库，没有做任何改进。且由于进货渠道的原因，试剂盒内的有些试剂他们是买不到的，质量就会大打折扣。比如DH10B 电转化感受态细胞，这个感受态细胞转化效率比国产的高出100倍以上。这个感受态细胞需要具有一堆的海关批文才能买到，其他公司由于没有相关资质，是无法进口的，据我们了解，国内某公司居然会用化学转化细胞代替电转化，质量影响巨大。

1. All-Direct专利方法，这个是我们的独家专利方法，是在invitrogen方法上做了重要改进，保留了其优点（不用PCR扩增，文库保真度高），去除了其需要经过两次重组的缺点，大大提高文库质量。平均长度较invitrogen方法可以提高200bp，库容量可以提高10倍以上。该方法对RNA的要求量和invitrogen方法一样。

6.2. 海科生物提供的酵母双杂文库有哪些产品内容？
我们提供的文库产品，包含了文库质量（大于200ug）以及大肠杆菌文库甘油菌。同时可以选择提供转化到酵母细胞的文库甘油菌，我们会提供100只转化到酵母细胞的文库甘油菌，可以做100次的文库筛选。
其中文库质粒可以使用共转的方法进行文库筛选，酵母细胞文库甘油菌可以使用maiting的方法进行文库筛选，根据老师的实验习惯可以自由选择，结果没有任何差异的。
6.3. 如何检测文库质量？
对于文库的质量，一个简单的金标准就是，样本内的所有基因都在文库里，且基因要有一半以上的全长基因，这个文库就是合格的。
对于文库的检测，可以针对我们交付的产品，做以下几个方面的检测：

1. 根据老师的样本信息，选择3-5个低拷贝的基因，设计合成引物，以我们提供的文库质粒为模板，进行PCR扩增，如果低拷贝的基因都能扩增出来，高拷贝的就不会丢失，文库质量即可以判断为合格。
2. 对于我们提供的大肠杆菌文库甘油菌，可以进行梯度稀释后铺板培养，第二天计算库容量，同时挑取单克隆进行PCR扩增和测序检测，以判断插入片段长度和空载率。

6.4. 如何评价文库质量？
文库质量的关键指标，主要是文库库容、空载率及插入片段平均长度。
文库的原始库容肯定是越高越好，我们公司承诺的是大于1*10^7的库容量，这个是原始库容量，也就是没有经过任何扩增过程，直接转化出来的库容量。比其他公司承诺的1*10^6的库容量要高10倍以上，下面详细解释下库容量的高低对文库质量的影响:
对于生物样本，除了低等生物，目前研究比较多的物种，比如人，大鼠，小鼠，其基因数在5*10^4左右，文库至少得100倍覆盖，也就是库容至少需要5*10^6以上。
对于植物样本，其基因数量比人的大很多，比如水稻样本，其基因数量为人的2-3倍，小麦样本，其基因数量为人的5-6倍，这样就需要更多的文库库容量。对于水稻样本，需要覆盖100倍的基因数，要求的文库原始库容量是大于1*10^7以上。市场上别的公司提供的文库最多只能覆盖10倍左右，这么低的覆盖度，必然造成大量基因的丢失。
对于有的公司宣传的，库容量不是越高越好，这绝对是不负责任的忽悠，为自己的文库质量不合格找不合理的借口。
对于插入基因长度，别的公司一般平均长度就在800bp左右，我们公司可以承诺做到1200bp以上，这个差距是巨大的，下面再详细介绍下插入片段长度对文库质量的影响：
一般的一个功能基因，其一般长度会在200个氨基酸以上，也就是编码区在600bp碱基以上，装入文库的基因，除了编码区，还会有5’UTR区，3‘UTR区以及polyA区域，这几个部分加起来，基因的长度一般至少会在1000bp以上。由于文库是个混合物，会存在竞争性抑制，短的基因过多，势必会影响长度基因的比例，以及长的基因的表达丰度。
我们的文库产品，插入片段平均长度会在1200bp以上，最短的会在1000bp左右。对于文库筛选，不是说只要有基因的一个片段就可以了，蛋白质的功能需要多种因素的参与，如果插入基因过短，筛选到的结果只是一个基因片段，甚至是靠近polyA的一小段基因，这个结果的可行度在哪里？基本都可以认为是假阳性的结果的。
对于有些公司宣称的，文库的基因插入片段不是越长越好，其实是对客户的极其不负责任和不合理的忽悠，只是因为自己没有技术做到更长的片段长度，而找的借口而已。
6.5. Mating和共转两种筛库方法到底哪种好？
共转和maiting两种方法，结果是一样的，只是一个文库质粒转到酵母细胞的方法，对于后续的文库筛选没有任何区别的，可以根据老师的实验习惯，自由选择的。