shRNA克隆/shRNA干扰

OmicsLink™ shRNA表达克隆是将针对靶基因设计shRNA（小发夹结构RNAi）靶点序列，然后将其装于表达载体中，我公司现可提供4套表达载体，可用于对人、小 鼠、大鼠以及其他物种的全基因组范围的基因表达抑制研究。我公司还提供相应的全长人类和小鼠基因的ORF表达克隆，可用于相应基因的功能获得研究，还可用 于shRNA克隆的确证。

OmicsLink™ shRNA表达克隆原理

图2. shRNA导致基因表达抑制的机制

我 公司提供基于shRNA技术的siRNA产品，可用于瞬时和稳定的基因表达抑制。表达质粒DNA或包含shRNA的病毒颗粒被导入靶细胞。使用哺乳动物启 动子驱动目的序列的转录，序列经设计包括茎（19-29对核苷酸）和环，随后由RNAi机制中的酶加工成为成熟的siRNA，siRNA和RISC复合体 对目的基因所转录的mRNA产生特异的切割降解作用，从而导致了基因表达抑制。 (见图2)

OmicsLink™ shRNA表达克隆的特性    

• 所有shRNA靶点序列的选取均经过准确算法计算。根据基因的不同， shRNA其茎的长度在19到29碱基对之间。这些保证shRNA克隆表达后有很高的表达抑制效率和最低的脱靶效应（off target effect）。
• 克隆shRNA 所采用的载体有慢病毒载体和以哺乳动物细胞为宿主的载体，各类载体拥有不同的启动子和跟踪标记基因可供选择。
• 载体中所带有的绿色荧光跟踪标记基因（ eGFP ）可以用于监测质粒载体的转染效率和转导病毒的感染效率。
• 载体结构上带有稳定细胞株的筛选标记（嘌呤霉素）和绿色荧光跟踪标记基因（EGFP ），这些特性使得该载体既能用于稳定抑制效应的研究，也可用于瞬时抑制效应的研究。
• 使用慢病毒载体系统，可转导shRNA进入常规的分裂细胞，以及不分裂而难以转染的目的细胞株。
• 载体的各部分序列已经过测序，包括启动子、编码shRNA的正义和反义链、发夹结构、终止子和其他接头序列。

OmicsLink™ shRNA表达克隆的应用    

• 基因表达下调 shRNA克隆对单个基因的基因表达抑制效应可以通过和一个包含不规则序列的阴性对照克隆来比较研究。
• 信号通路研究 我 公司的人类基因ORF克隆按照不同的信号传导、代谢、疾病通路和相关性、基因家族等进行了分类。将已知同一通路的shRNA克隆以96孔或384孔板的形 式排列在一起，可一次研究一组基因在某一信号通路中的功能。目前我公司已可提供针对人类全部激酶基因的shRNA克隆，并已按照按不同激酶的功能进行了分 类。
• ORF表达克隆确证 我公司已有shRNA相应人类靶基因的ORF克隆，可装在各种表达载体中，带有不同的标签和跟踪标记基因。这些正常的ORF表达克隆和在shRNA靶序列带有沉默突变的同样的ORF表达克隆，可以用于shRNA确认研究和基因功能拯救研究。

OmicsLink™ shRNA表达克隆的基因表达抑制效应的检测方法

• q-RT-PCR检测 shRNA的表达，能导致目的基因所转录的mRNA被切割和降解，从而降低蛋白的表达，所以推荐检测表达抑制效应的第一步是做q-RT-PCR。我公司提供确证过的对应目的基因的q-RT-PCR引物（和其他已报导的转录体）。
• Western blot检测 检测表达抑制效应，大部分都需要用Western Blot方法来检测所表达蛋白表达水平的下调。我公司提供2500多种单克隆抗体和针对人类蛋白的多克隆抗体。
• 功能检测 检测表达抑制效应，还可通过生物和生化的终点分析方法，分析细胞增殖、克隆形成、细胞周期、细胞迁移等，根据目的基因具体的功能而定。
• 跟踪标记基因或蛋白进行功能检测 当 所研究基因的内源转录水平很低，并且/或者q-RT-PCR和WB检测不适宜的时候， 表达抑制效应也可通过共转导shRNA克隆和一个含目的基因并带了跟踪标记基因的表达克隆，跟踪标记基因所编码的报告蛋白可用于功能检测。靶基因的 mRNA遭shRNA的破坏，就同时导致了跟踪标记基因的mRNA遭破坏，从而表现为报告蛋白的表达下降。这样，表达抑制效应就可以用报告蛋白的酶活性分 析结果来进行量化。

产品保证

shRNA 表达克隆的表达框已经全长测序，包括启动子、正义和反义靶序列、发夹结构、终止信号及其他接头序列。 对于构建到psi-sH1载体中的人类激酶组shRNA克隆，我们每个基因提供1~3个克隆，所有克隆均已通过AP色度法确证其对靶基因的表达抑制水平达 到70％以上。对于构建到慢病毒和哺乳动物载体的shRNA克隆，我们每个基因提供4个克隆。我们保证至少有1个克隆达到在mRNA水平对靶基因的表达抑 制水平达到70%以上，前提是用前面所提的检测方法，并严格按照说明书所提供的操作流程和注意事项进行实验。如果经过我公司核实，的确4个中没有1个有所 期望的表达抑制水平的话，我公司承诺免费更换1-4个shRNA克隆。