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RNA干扰载体shRNA质粒构建
均一化cDNA文库构建
载体构建
通过海淀分局认证 
| 服务名称： | Real-time PCR技术服务 |
| 规格： | *** |
- 根据客户提供的基因信息，评估服务可行性
- 签订Real-time PCR技术服务合同
- Real-time PCR预实验
- 样本DNA/RNA提取
- RNA逆转录为cDNA
- 引物/探针设计和引物合成及优化（采用公司专利技术，极大减少引物二聚体形成）
- 制备阳性克隆及测序（绝对定量）
- 阳性克隆质粒的测定、校正及标准曲线确定
- 内参引物和标准品的制备(如GAPDH、β-actin、β-tubulin等)
- 样本DNA/cDNA的检测（单个样本重复3次，每次3个重复孔）
- 数据处理与统计
- 提供实验原始数据及分析报告
2、主要荧光化学物质
①荧光染料：
主要有SYBR Green I, SYBR Green ER，Power SYBR,Eva GreenTM等。SYBR Green I 是一种与双链DNA小沟结合的荧光染料，SYBR Green I只与双链DNA结合才能发出荧光，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号（图1），荧光信号与双链DNA分子数成正比，随着扩增产物增加而增加，荧光信号的强度代表了反应体系中双链DNA分子的数量。
| 荧光染料SYBR Green I主要优点 | 荧光染料（SYBR Green I）主要缺点 |
| 灵敏度高（高于TaqMan，分子信标等探针方法） | 特异性差（易产生非特异性扩增，特异性低于TaqMan，分子信标等探针方法） |
| 成本低廉 | 稳定性差 |
| 通用性好 | SYBR Green I对PCR有一定的抑制作用 |
主要有TaqMan，MGB-TaqMan等，常用的报告基团有FAM、JOE、HEX、TET、VIC等，淬灭基团有TAMRA、Eclipse等。水解探针以TaqMan探针为代表，也称为外切核酸酶探针。TaqMan技术是美国PE公司（后被ABI收购）在1996年研发的一种实时荧光定量PCR技术。其原理为是利用Taq酶的5’端外切酶活性，即Taq酶具有天然的5’-3’核酸外切酶活性，裂解双链DNA5’端的核苷酸，释放出单个寡核苷酸。PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累，因此荧光强度与扩增产物的数量呈正比关系（图2），从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成。因此根据PCR反应体系中的荧光强度即可计算出初始模板量。
| 水解探针（TaqMan）主要优点 | 水解探针（TaqMan）主要缺点 |
| 特异性高 | 适用于特定靶基因的检测 |
| 临床上最为常用 | 本底（背景）较高 |
| 适用于SNP检测 | 易受Taq酶5’－3’活性的影响 |
| 成本较高 |
③分子信标：
分子信标（molecular beacon）技术是一种基于荧光共振能量转移原理建立起来的新型荧光定量技术。分子信标是一种呈发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，两端的核酸序列互补，因此标记在一端的荧光基团与标记在另一端的淬灭基团紧紧靠近。当加热变性会互补配对的茎环双链解开，如果有模板存在环序列将与模板配对，分子信标将成链状而非发夹状，使得荧光基团与淬灭剂分开。当荧光基团被激发时，因淬灭作用被解除，发出激发光子（图3）。
| 水解探针（TaqMan）主要优点 | 水解探针（TaqMan）主要缺点 |
| 特异性高（高于荧光染料和TaqMan水解探针） | 成本较高 |
| 适用于大规模自动化检测 | 稳定性不如TaqMan水解探针 |
| 本底（背景）较低 | 探针设计有一定的难度 |
