操作步骤 | |
| 1. 将单一目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下(尽量切除多余部分),放入干净的离心管(自备)中,称取重量。 |
| 注意:若胶块的体积过大,可将胶块切成碎块。 |
| 2. 向胶块中加入3倍体积Buffer 1#;当琼脂糖凝胶浓度>2%时,建议使用6倍体积Buffer 1#(如凝胶重为100 mg,其体积可视为100 μl,依此类推)。 |
| 3. 50℃孵育10min,其间每隔2-3min温和地上下颠倒离心管,以确保胶块充分溶解。如果还有未溶的胶块,可再补加一些溶胶液或继续放置几分钟,直至胶块完全溶解。 |
| 注意:1)胶块完全溶解后最好将胶溶液温度降至室温再上柱,因为吸附柱在较高温度时结合 DNA 的能力较弱。 |
| 2)在胶充分溶解后检测 pH 值,若 pH 值大于 7.5,可向含有 DNA 的胶溶液中加 10-30 μl 的 3 M 醋酸钠(pH 5.0)将pH 值调到 5-7。 |
| 4. 加入1倍胶体积异丙醇,上下颠倒混匀(如凝胶为100mg,则加入100μl异丙醇)。 |
| 5. 柱平衡:向吸附柱(吸附柱应预先装入收集管中)中加入200 μl Buffer 2#,12,000rpm(~13,400×g)离心2min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中。 |
| 6. 将步骤4所得溶液加入到吸附柱(吸附柱应预先装入收集管中)中,室温放置2min,12,000rpm离心1min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱放回收集管中。 |
| 注意:吸附柱容积为700 μl,若样品体积大于700 μl 可分批加入。 |
| 7. 吸附柱中加入500 μl Buffer 1#,12,000rpm离心1min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱放回收集管中。 |
| 8. 向吸附柱中加入650 μl Buffer 3#(使用前请先检查是否已加入无水乙醇),12,000rpm离心1min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱放回收集管中。 |
| 注意:如果纯化的DNA用于盐敏感的实验(例如平末端连接或直接测序),建议加入Buffer 3#静置2-5min再离心。 |
| 9. 12,000 rpm离心1min,倒掉收集管中的废液。将吸附柱置于室温数分钟,以彻底晾干。 |
| 注意:这一步的目的是将吸附柱中残余的乙醇去除,乙醇的残留会影响后续的酶促反应(酶切、PCR等)。为确保下游实验不受残留乙醇的影响,建议将吸附柱开盖,置于室温放置数分钟,以彻底晾干吸附材料中残余的乙醇。 |