pQC-tTS-IN ptTS-Neo pSIREN-RetroQ-TetP-Luc RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-TetP-Luc

pQC-tTS-IN
ptTS-Neo
pSIREN-RetroQ-TetP-Luc
RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-TetP-Luc

ClONTECH的Knockout 诱导RNA干扰系统可以让使用者严谨调控功能shRNAs（small hairpin RNAs)在哺乳动物细胞内的表达，从而使得目标基因处于沉默状态。该系统使用可诱导的逆转病毒shRNAs表达载体。该载体已经预先线性化可以直接连接用于编码shRNA的双链寡核苷酸。

   CLONTECH的可诱导RNA干扰系统在用于抑制可能是致命基因的操作中非常有用。在缺乏诱导物（Tc 或 Dox)时，shRNA的诱导表达是非常低的。这一点非常关键，因为即使是shRNA低水平的表达也可以对目标基因产生重要抑制。该系统也可产生的高效诱导shRNA表达，对目的基因的蛋白表达进行强烈抑制。

  RNA干扰的诱导机制

  CLONTECH的RNA干扰诱导系统使用了改良过的严谨控制机制。四环素诱导调控的基因表达机制已被Gossen 和Bujard等人描述过。该系统设计的机理是当四环素（Tc)或者强力霉素（Dox 四环素衍生物）加入工程细胞的培养基内。诱导shRNA通过RNAi干扰导致目的基因沉默。该系统对环境中Tc或Dox的浓度变化产生应答，表达出抑制目标基因的shRNA.该系统非常适合抑制对宿主细胞有毒的基因表达。

  该系统依赖于两个组成部分：调控蛋白和Tet应答的启动子，该启动子活性受到可与之结合的调控蛋白（tTS)的调控。调控蛋白是一个受四环素控制的转录抑制因子。tTS是一个TetR（ tet 抑制蛋白)和Kid-1蛋白的KRAB-AB沉默域复合表达高效的抑制因子。 在没有Tc或者Dox时。tTS从在tetO序列的启动子下游紧密地结合Tet操作子序列和KRAB-AB结合域作为一个强的转录抑制子。

  该系统提供两个载体来表达tTS调控子，一个是ptTS-Neo应答质粒载体，可以用来感染目标细胞。令一个是逆转录病毒载体pQC-tTS-IN通过逆转录病毒感染细胞，用来生产tTS稳定表达的细胞系。两种质粒均包括了新霉素抗性基因可以用来设计筛选最终得到包括tTS和重组的应答质粒的双稳定细胞系。

   该系统内的应答质粒包含了Tet-应答U6启动子，用来启动shRNA的表达。该复合启动子（PTREmod/U6)包括Tet应答子和U6启动子。从用于标准的Tet应答质粒Ptight启动子启动转录。 在没有Tc或Dox时，tTS结合TRE内的tetO序列，从U6启动子开始的shRNA转录受到抑制。当培养液内加入Tc或者Dox时，tTS从TRE上脱离，转录抑制得到解除，转录通过复合的TRE/U6启动子开始进行。

图1。CLONTECH RNA干扰诱导系统使用改良的严密调控的四环素控制的基因表达系统。在没有Tc或者Dox时，tTS结合TRE中的tetO序列。抑制U6启动子下游的shRNA的转录。当培养液内加入Tc或者Dox时，tTS从TRE上脱离，转录抑制得到解除，转录通过复合的TRE/U6启动子开始进行。

  CLONTECH提供了包含Tet应答启动子的应答质粒，RNAi-Ready pSIRENRetroQ-TetH和RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-TetP。RNAi-Ready pSIRENRetroQ-TetH 载体包含了潮霉素抗性基因。可以用来筛选稳定转染的细胞系，RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-TetP载体包含了嘌呤霉素的抗性基因。两种载体可用来表达目的shRNA。而且可避免在整合过的前病毒中从上游的LTR序列开始的启动子干扰风险.另外，通过逆转录病毒转染可以让你的shRNA高效进入目的细胞。

两种方法用来制造可诱导的RNAi细胞系

  最终要建立一个调控质粒和应答质粒双稳定表达的细胞系。为完成这项工作，你可以使用该系统所提供的应答和调控载体来建立。你也可以将构建的表达shRNA的应答质粒转入从我们预制的已整合tTS稳定表达的细胞系。

系统特点：

快速高倍应答和高水平诱导：

在该系统中，启动子的调控是一个活跃过程，受到tTS转录抑制子的控制。tTS抑制子在启动子序列区积极抑制聚合酶活性而不是用一个被动的方式简单结合聚合酶到TATA框。所以该系统并不需要高水平的抑制子表达来产生大量的抑制子来实现更快的诱导和更严密的控制。相比之下。其他可诱导的RNAi系统单纯依赖抑制因子直接结合聚合酶来占据空间位点，产生空间位阻来阻碍shRNA的转录。如只通过抑制蛋白的作用，像TetR,抑制需要大量但很困难得到的高水平的抑制因子，来确保100%占据调控位点。即使有可能可以得到大量的抑制子，大量抑制子的存在也使得迅速和高水平的抑制难以实现。

CLONTECH 可诱导的RNAi系统，加入Dox后，可以在24小时内看到目的基因蛋白表达的抑制效果。最大的抑制效果在48小时比较明显。于之相比，其他诱导表达系统抑制效果出现相当缓慢。（甚至于几天时间），做瞬时转染时，转染之前需用Dox预处理来彻底缓和抑制作用。这些导致不完全诱导（与无抑制调控相比）。该抑制调控系统需要高量的Dox（2-5ug）来确保取消抑制，我们已经发现tTS调控系统灵敏度最小量在10ng/ml Dox。

图2.在HEK293和HeLa细胞中强力霉素诱导的干扰。 A.HEK 293 tTS 细胞系（目录号630927）稳定表达tTS抑制因子，每孔中存在1x105细胞

用pSIREN-RetroQ-TetP-Luc 载体（表达荧光霉素和shRNA)和荧光素酶表达载体按1：1比例转染。由应答曲线可看出存在80%对荧光素酶光单位（RLU relative light units)干扰荧光素酶活性在48小时的10ng/ml Dox诱导。B.Hela tTS 细胞系被Tet应答的U6启动子驱动的shRNA表达盒，直接来抑制Lamin A/C 表达。在转染48小时后，在缺乏或者存在DOX情况下，细胞被溶解用western 分析。  Lamin A/C 和b-actin (作为对照）C.双亲HeLa tTS细胞系

-=没有Dox的转染细胞

+=带Dox（1 µg/ml）的转染的细胞

在HEK293和Hela细胞中强力霉素诱导系统。