TonkBio同源重组试剂盒

货号：	TB10012A
CAS号：	详情电联
供应商：	上海同科生物科技有限公司
数量：	100000000
英文名：	TonkBio Quick-Fusion Cloning Kit
保质期：	详见包装盒
保存条件：	储存于-20℃
规格：	10 rxns/50 rxns/100 rxns

同科生物为您提供分子克隆领域所需全线产品，包含基因重组/克隆、电泳检测、核酸提取/纯化、PCR/qPCR/RT-PCR以及细胞因子等系列产品，各类产品均得到客户高度认可，且反馈良好。同科生物本公司为客户提供优质产品的同时，产品价格也较有竞争力，尤其是促销季节产品价格有明显优势，目前我公司各类产品均有免费试用申请，欢迎试用，咨询热线400-055-6588。

产品名称：TonkBio 同源重组试剂盒
英文名称：TonkBio Quick-Fusion Cloning Kit    
产品规格：

TB10012A	10 rxns	￥441
TB10012B	50 rxns	￥900
TB10012C	100 rxns	￥1530

 
产品组成：
1、Fast-Fusion Enzyme
2、10× Fast-Fusion Buffer
产品简介：
TonkBio 同源重组试剂盒基于DNA序列同源性进行片段重组，可将插入片段PCR产物定向克隆至任意载体的任意位点。将载体在克隆位点进行线性化，并在插入片段PCR引物5’端引入线性化克隆载体末端序列，使得插入片段PCR产物5’和3’最末端分别带有和线性化克隆载体两末端对应的完全一致的序列 (15 bp～21 bp)。这种两端带有载体末端序列的PCR产物和线性化克隆载体按一定比例混合后，在Fast-Fusion Enzyme的催化下，最快仅需反应5 min，即可进行转化，完成定向克隆。克隆阳性率可达95%以上。
产品特点：
1、操作简便：无需考虑酶切点限制；
2、快速重组：15min实现载体和片段的快速重组；
3、效率更高：重组效率为传统酶切连接技术的5-10倍，无载体自连现象，阳性克隆可达90%以上。
产品应用：
1、PCR产物克隆进载体
2、基因转移
3、在插入片段前后插入adaptor、linker和标签
4、高通量克隆
实验方案
A．实验流程概览

B．制备线性化载体
环形载体需要经过线性化处理，使载体待重组区域暴露出来，以供与插入片段进行重组拼接。线性化的方法可以通过限制性内切酶酶切或PCR方法实现。若采用酶切进行线性化处理，推荐进行琼脂糖凝胶电泳检测，并切胶回收，以尽量避免为切割载体在转化后造成假阳性结果。若PCR扩增得到线性化载体，推荐使用高保真聚合酶进行扩增，减少PCR体系中的模板用量以减少初始质粒造成的假阳性，并在PCR结束后对产物进行切胶回收或使用DpnI酶消化残余质粒模板。
 
C. 插入片段的PCR引物设计
为了实现同源重组，插入片段扩增产物5’和3’末端需要带有和线性化克隆载体两个末端对应的完全一致的序列（15−21 bp）。下图以pUC19作为克隆载体为例，设计引物：

	Forward Primer →
	15 bp tract (F)        BamHI   Gene-specific Primer
	5’-CAG GTC GAC TCT AGA GGATCC XXX XXX …-3’
Vecor pUC19 Clone site	5’-TGC CTG CAG GTC GAC TCT AGA G	AATTC ACT GGC CGT CGT TTT ACA ACG-3’
	3’-ACG GAC GTC CAG CTG AGA TCT CCTAG	G TGA CCG GCA GCA AAA TGT TGC-5’
	3’-… XXX XXX CTTAAG TGA CCG GCA GCA AAA-5’
	Gene-specific Primer  EcoRI      15 bp tract (R)
	← Reverse Primer

D. 插入片段的PCR扩增
插入片段可选用任何DNA聚合酶进行扩增，Taq DNA聚合酶或其他具有校正活力的高保真酶都可以。若用Taq DNA聚合酶，产物末端的A尾在重组过程中将会被去除，不会因此产生单碱基插入突变。推荐使用高保真酶进行扩增，以减少在插入片段中引入突变。请在PCR完成后，进行琼脂糖凝胶电泳，确认获得单一条带的DNA片段。可切胶回收以除去模板、引物、引物二聚体。可通过与已知的DNA分子量marker比较，确定得到的DNA量。
 
E．重组反应体系的建立以及反应条件
在冰水浴中，配制如下反应体系，将缓冲、水、线性化载体、插入片段加入PCR管中，轻弹混匀，最后加入酶。

组成成分	用量
10× Fast-Fusion Buffer	1 μl
线性化载体	20−100 ng
插入片段	10−100 ng
ddH2O	补加至10 μl
Fast-Fusion Enzyme	1 μl *

最适线性化克隆载体与插入片段摩尔比为1:2，可由下列公式粗略计算获得：
Ø 线性化载体 = [0.01 × 线性化载体长度 (bp)] ng
Ø 插入片段 = [0.01 × 插入片段长度 (bp)] ng
例如将长度500 bp的插入片段克隆到长度2.7 kb的pUC19中，克隆载体的最适使用量为：0.01×2700=27 ng，插入片段的最适使用量为：0.02×500=10 ng。
注意：1. 当插入片段大于克隆载体时，两者计算用量公式应互换。
2. 线性化载体用量应在20−100 ng之间，插入片段扩增产物用量应在10−100 ng之间。当使用上述公式计算DNA用量超出这个范围是，请直接选择最低/最高使用量即可。例如插入片段200 bp，最适用量计算值为4 ng，实际反应体系中应加入10 ng。
反应体系配制完成后，轻弹混匀，并通过短暂离心使其沉到管底，立即放入已预热的PCR仪或平衡至所需温度的水浴中。按下表中方案选其一进行。推荐在PCR仪中进行反应，60°C，15 min。（若选择在37°C水浴反应，请在10 μl反应中加入2 μl Fast-Fusion Enzyme。）反应结束后应立即将反应管置于冰水浴中冷却10 min，然后直接转化。也可选择−20°C储存，待需要时，冰上解冻并转化。

PCR热循环仪		水浴
70°C, 5 min	60°C, 15 min	37°C, 15 min
4°C, ∞	4°C, ∞	冰水浴

 
F．转化
推荐使用转化效率≥10⁸ cfu/μg的感受态细胞，按照对应的说明书操作。若转化效率低于10⁸ cfu/μg，可在凃布前将培养的菌液在6000 rpm离心5 min，沉菌用100 μl培养基重悬后，全部涂于对应抗性的平板上。过夜培养后，形成数百个单克隆，可根据需要选择PCR或酶切鉴定是否为阳性。
 
G．常见问题与解决方案

问题	可能的原因	解决方案
平板上无克隆或克隆数目很少	引物序列不正确	l 确认引物序列含有15 bp与载体插入区域完全一致的同源序列。
	PCR产物不纯	l 优化PCR扩增反应以得到单一PCR产物。 l 换一种纯化方法，纯化您的PCR产物。
	反应体系中DNA浓度太低	l 在重组反应中，加入推荐的DNA量。
	不纯的载体或插入片段抑制重组反应	l 推荐采用胶回收或离心柱法纯化DNA后进行重组反应。
	转化过程中加入重组反应液过多	l 重组反应液的转化体积不应超过转化细胞体积的1/10。
	感受态细胞转化效率低	l 更换新鲜、高效的感受态细胞。
	培养基中加入错误或过多抗生素	l 在转化平板中加入正确、适量的抗生素。
假阳性克隆数目多	克隆载体线性化不完全	l 重新酶切您的载体，增加酶切时间，并胶回收纯化。
	PCR使用的模板质粒抗性与所需克隆载体抗性相同造成的污染	l 可在PCR反应之前先将模板质粒线性化。 l PCR产物用DpnI处理，消化模板质粒，然后再纯化。
	转化用平板放置时间过长导致抗性失效	l 确认平板新鲜配置，并含有正确、适量的抗生素。
克隆含有不正确的插入片段	PCR产物混有非特异性片段	l 优化PCR扩增体系，提高特异性或胶回收纯化目的片段。

同科生物简介：成立于2007年，是一家集研发、生产、销售和技术服务于一体专注于生命医学和生物技术领域的高科技企业。主营业务有科研产品、诊断试剂、分子诊断和技术服务等，主要服务于科研机构、大专院校、医院和工业等客户。
生产科研：同科生物www.toneker.com搭建多个研发与合作技术平台（博士后实践基地、院士工作站、同济大学人才培养与产学研合作基地及生物研究中心等），为技术创新提供了坚实的基础保障。拥有三类体外试剂生产中心、仪器生产中心、研发质检实验室等、厂房和实验面积达8000多平米，仪器设备设施先进齐全（包括定量PCR仪、生物安全柜、核酸蛋白测定仪、高压细胞破碎仪、FPLC等系列高端精密仪器设备）。
研发团队：同科拥有一支由中科院院士为顾问，国家千人为首席科学家，以博士硕士为主体的高效的国际化研发团队。研发人员专业涵盖生物化学、分子生物学、临床医学、免疫学、药物制剂、生物技术、遗传学、微生物学、生物工程领域，关联性较大，专业结构合理，且形成互补，在重大项目及关键技术上具备卓越的攻关能力。
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