货号: | oneshineF0002 |
规格: | 7万元/株 |
一、原理
此系统包括lentiSAMv2质粒和lenti MS2-P65-HSF1_Hygro质粒。lentiSAMv2质粒如图一所示,其中,eSpcas9(1.1)也叫做dCas9,是将Cas9酶切位点突变后形成的,它只具有结合基因组和sgRNA的能力,而不具备切割DNA的能力。lentiSAMv2质粒的sgRNA经过改造,在sgRNA后面加入了19个碱基(MS2 binding site)。这19个碱基经过转录后形成一个具有茎环结构的RNA,此RNA能特异性地与MS2蛋白结合。而在另一个载体lenti MS2-P65-HSF1_Hygro质粒上,MS2蛋白已经与P65、HSF1蛋白融合。其中,P65、HSF1是两个转录因子。因此,当两个载体同时进入同一个细胞后,lentiSAMv2质粒表达“sgRNA- MS2 binding site“融合RNA及dCas9蛋白,lenti MS2-P65-HSF1_Hygro载体表达MS2-P65-HSF1融合蛋白。在dCas9作用下,则形成“基因组DNA-dCas9-sgRNA-MS2 binding site-MS2- P65-HSF1”这一超级复合体。当sgRNA为转录起始位点时,此超级复合体定位于转录起始位点,由于P65、HSF1可以募集更多转录因子,因此可启动转录,从而激活转录起始位点后面的基因表达。
我们合成了7万多个转录起始位点的sgRNA(对应2万多个基因),分别载入lentiSAMv2质粒中,再把此7万多个质粒混合起来,形成文库。并且我们将此文库整合到了细胞中,一个125cm2细胞培养瓶中含有约108个细胞,每个细胞被激活一个基因,共约2万个基因被激活,所以含有每个特定激活基因的细胞约有5000个(108/2万)。
二、参数
靶基因物种:人
靶基因数目:23,430
gRNA数目:70,290
细胞类型:胃癌、乳腺癌、结肠癌等癌细胞系和永生化的细胞系。
价格:7万元/株
三、应用
【应用举例:细胞凋亡相关基因筛选】
取细胞文库进行扩增,然后平均分成两份,每一份包含108个细胞,每个细胞被激活了一个基因,共约2万个基因被激活,所以含有每个特定激活基因的细胞约有5000个(108/2万)。向其中一份细胞中加入放线菌素D、诱导细胞凋亡(A组),在另一份细胞中加入溶剂、作为对照(B组)。A组用流式细胞仪筛选出凋亡细胞A1、未凋亡细胞A2。B组用流式细胞仪筛选出凋亡细胞B1、未凋亡细胞B2。分别对A1、A2、B1、B2进行短测序,检测哪些基因被激活了。A2中被激活的细胞即为能抵抗凋亡的基因,B1中被激活的基因即为能诱导凋亡的基因。其它应用:
(1)新药靶点确定与验证
(2)环状RNA上游调控机制分析、下游调控机理分析
(3)Long noncoding RNA作用机制验证
(4)脂肪代谢机制研究
(5)干细胞自我更新、不对称性分裂机制等。