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均一化cDNA文库指原不同丰度基因的cDNA拷贝数通过DSN酶处理等方法而相互接近后构建的文库,相对提高了细胞中大部分低丰度基因的转录本在文库中的拷贝数,克服了基因转录水平上的差异给文库筛选和分析带来的障碍,大大增加了低丰度基因的检出或克隆几率,也因此在EST测序过程中避免了大量相同cDNA克隆的干扰。
我们对外开展高质量的均一化cDNA文库构建服务,采用Clontech公司的CreatorTM SMARTTM cDNA Library Construction Kit与DSN酶作均一化处理相结合的技术构建文库。总 RNA抽提及mRNA纯化是最关键的第一步,必须保证RNA(mRNA)的完整性和纯度;其次是cDNA的均一化处理。
样品要求
材料要求新鲜、RNA无降解;样品量:组织(2~3g),细胞(10 8),总RNA量50~100μg(>0.3μg/μl)或mRNA量2~3μg(>0.3μg/μl);最低总RNA量为2~3μg(>300ng/μl),最低mRNA量为0.2~0.3μg(>30ng/μl)。其余详见“文库构建”中的要求。
服务流程
提取总RNA,纯化mRNA,合成cDNA第一链,单链cDNA的均一化处理,合成均一化的双链cDNA;或(材料有限的情况下)提取总RNA,合成cDNA第一链,合成双链cDNA,双链cDNA的均一化处理。然后将均一化的双链cDNA用SfiI酶切,连接到载体,转化或包装,扩增及保存。
完成时间
6~8周内完成。对于有些RNA难以抽提的材料或样品材料本身质量问题,时间较长,会在1周内和客户协商约定时间。
最终产品
1、产物电泳图谱;
2、初始库,保存在-20℃;
3、文库评价的数据,包括库容量,滴度,插入片段的平均长度,重组效率。库容量:初始文库的滴度在1 ×106 以上,重组效率大于90% ;如果需要扩增,保证扩增后滴度在109 左右,库容量大于1×105。插入片段平均长度据不同物种情况而定,植物或高等动物文库的插入片段大于1Kb。
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