酵母双杂交文库筛选技术服务

服务名称：	专业提供酵母双杂交文库筛选技术服务
提供商：	博耘众欣生物

技术背景

酵母双杂交系统（Yeast two-hybrid system，Y2H）的建立与发展基于真核生物转录调控系统，充分利用了真核转录激活因子的组件式结构。转录激活因子通常有两个可分割的、功能相互独立的结构域，即：DNA特异性结合结构域(DNA-binding domain, DBD)和转录激活结构域(activation domain AD)。DBD结合靶基因上游的操纵子序列，然后AD聚集RNA聚合酶II复合物，从而启动转录。这两个结构域分开时仍各具有功能，但不能激活转录，只有当被分开的两者通过适当的途径在空间上较为接近时，才能重新呈现完整的转录因子活性，并可激活上游激活序列（upstreamactivatingsequence, UAS）的启动子，使下游靶基因得到转录（图A，B）。基于这一特性，Fields等人于1989年设计了一个检测蛋白质间相互作用的系统，即酵母双杂交系统。
 
       在传统的酵母双杂交技术中，将两个待测蛋白分别与DBD和AD结构域融合，形成的融合蛋白分别称为“bait”蛋白（即诱饵，或已知蛋白，或X蛋白）和“prey”蛋白（即猎物，或靶蛋白，或Y蛋白）(图C，D)。如果这两个待测蛋白存在相互作用，那么融合蛋白上的DBD和AD就能重新形成有活性的转录激活因子，从而激活靶基因的表达(图E)。人为地将靶基因构建为表达蛋白容易鉴定的基因，称为报告基因（reportgene），从而通过检测报告基因的表达，来筛选这两个待测蛋白是否存在相互作用。

Y2H原理
 


Y2H应用
 
1. 检测并验证两个已知蛋白质间的相互作用
2. 筛选兴趣蛋白与新的蛋白质间相互作用（即cDNA文库筛选）
3. 绘制蛋白质间相互作用图谱
4. 寻找具有药物治疗作用的小分子多肽
 
特点与优点
 
       酵母双杂交系统的最主要的应用是快速、直接分析已知蛋白之间的相互作用及分离新的与已知蛋白作用的配体及其编码基因。
酵母双杂交系统检测蛋白之间的相互作用具有以下优点:
 1. 作用信号是在融合基因表达后，在细胞内重建转录因子的作用而给出的，省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。
 2. 检测在活细胞内进行，可以在一定程度上代表细胞内的真实情况。
 3. 检测的结果可以是基因表达产物的积累效应，因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用。
 4. 酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库，能分析细胞浆、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能的蛋白。
 5. 可以用来比对病变组织，更快的找到突变基因或者导致变异的蛋白，更快的找到攻克方向。
 6. 以用作大规模的蛋白筛选，在较短时间内对找到某些药物对相关组织主要的作用蛋白，对于药物的修饰和改进明确方向。
 7. 可以反复使用，培养快捷，适合大规模筛选使用。
 
技术平台
 
我们可根据客户需要，分别提供适用于浆蛋白、核蛋白及膜蛋白酵母双杂交实验服务的两套系统
1. Clontech GAL4-based two-hybrid system：适用于靶蛋白是浆蛋白、核蛋白
2. Stratagene Cytotrap Psos system：适用于靶蛋白是膜蛋白
传统的酵母双杂交系统适用于核内蛋白质间相互作用的研究，对于膜蛋白质、膜相关蛋白和可溶性蛋白间相互作用的研究存在一定的局限性；另外只能检测发生在核内的蛋白质间相互作用，无法检测胞膜或胞质的蛋白质间相互作用；不少蛋白质需在内质网或细胞质中经过转录后修饰，才能与其他蛋白质发生相互作用，传统的酵母双杂交无法检测；有些蛋白质本身就是转录激活因子，可以对报告基因的表达进行调控，传统的酵母双杂交也无法检测。以上局限性在一定程度上限制了它的使用范围，不能够完全满足科研的需求，全新的膜蛋白杂交系统突破了传统酵母双杂交的局限，扩大了酵母双杂交的应用范围，可以满足更多客户的需求。
 
文库资源
 
       目前我公司已拥有包括人全组织，人胚脑，人胚肺，人胚肝，人睾丸，人脾，小鼠全组织，小鼠肺和小鼠脾等多种组织来源的高库容量文库，可以免费向文库筛选客户提供使用，为您节省大量实验经费，大大提高实验效率和成功率。
 
服务内容
 

1. Y2H cDNA文库构建

 
技术服务内容：总RNA提取、纯化―mRNA分离―cDNA制备―cDNA连接AD载体－连接产物转化大肠杆菌－cDNA文库效价测定－cDNA文库扩增－cDNA文库扩增后的质粒DNA纯化－纯化后cDNA文库质量的鉴定（如PCR和酶切鉴定等方法）等
 
合作方式：为客户构建指定的酵母双杂交基因文库。由客户提供cDNA 或组织、细胞。
 
服务完成时提供详细的实验报告以及三种形式的文库： A该文库转化的大肠杆菌甘油冻存管 B 对转化到宿主菌中的文库进行进一步扩增，获得扩增后的文库大肠杆菌冻存管 C 对扩增的文库提质粒DNA纯化，获得纯化后的文库质粒DNA。
 
周期：2个月。
 
单价：询价
 
2.  Y2H 文库筛选
 
技术服务内容：载体构建和测序；自激活检验；酵母双杂交和阳性克隆的鉴定，测序，信息学分析。 合作方式：为客户对指定的基因文库进行酵母双杂交筛选。由客户提供诱饵基因和基因文库。
 
筛选完成后向客户提供详细的筛选报告和阳性克隆实物。
 
周期：3个月。
单价：询价
 
3.  Y2H 检测指定基因对之间的相互作用
 
技术服务内容：把X基因和Y基因分别转入AD、BD载体，共转化酵母，通过酵母双杂交系统检测他们之间的相互作用。
合作方式：为客户对指定的2个或多个基因之间进行酵母双杂交实验，验证其相互作用。由客户提供基因克隆。
 
实验完成后向客户提供详细的实验报告和相互作用阳性的酵母共转化菌株。
 
周期：35个工作日
 
单价：询价


服务案例

我公司已经成功为国内外多家科研机构完成了酵母双杂交实验委托项目，受到了广泛好评，并积累了丰富的科研服务经验。我们的合作单位包括天津大学，天津医科大学，北京大学医学院，第三军医大学等多家科研单位。以下是某项酵母双杂交项目实施过程中的部分结果图片：