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酯化液
M-MLV GIII First-Strand Synthesis
图尔思eSpCas9（1.1）蛋白
通过合肥市工商行政管理局蜀山区分局认证 
| 货号： | ER0271 |
| 供应商： | 合肥基赛生物科技有限公司 |
| 保存条件： | -20度 |
| 规格： | 5000 units |
Product information
5'...G^A A T T C...3'
3'...C T T A A^G...5'
Reaction conditions
| Recommended buffer for 100% activity | Optimal temperature | Enzyme activity in Fermentasbuffers, % | Tango buffer for double digestion | |||||
| B(blue) | G(green) 1× | O(orange)1× | R (red) 1× | Tango(yellow) 1×/2× | ||||
| EcoRI | 37°C | 0-20 | NR | 100 | 100* | NR | 100 | 2× |
100%酶活性的反应条件
1× 缓冲液EcoRI：
50 mM Tris-HCl (pH 7.5, 37°C), 10 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.02% Triton X-100, 0.1 mg/ml BSA。
37°C酶切。
保存缓冲液
EcoRI保存在：
10 mM磷酸钾 (pH 7.4, 25°C), 300 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.2 mg/ml BSA, 0.15% Triton X-100和50%(v/v)甘油。
连接和重新酶切
50倍EcoRI过量酶切后，超过95%的酶切产物可以连接和重新酶切。
琼脂糖包埋DNA酶切
至少需要5 unit限制酶才能在16小时内完全切割1 µg琼脂糖包埋的λ DNA。
注：低盐、过量酶切、pH>8.0或用Mn2+替代Mg2+都会导致星活性。
兼容性末端
XapI, MunI, TasI。
甲基化影响
Dam: 无重叠 – 不影响。
Dcm: 无重叠 – 不影响。
CpG: 可能重叠 – 部分影响。
EcoKI: 无重叠 – 不影响。
EcoBI: 可能重叠 – 不影响。
| Methylation type | Sequence | Cleavage effect |
| CpG | 5'...m5C GAATTm5C G...3' 3'... Gm5CTTAA Gm5C...5' | 部分影响 |
| EcoBI (TGA(N)8TGCT) | 5'...TGm6AATTC(N)4TGCT...3' 3'...ACTTAAG(N)4m6ACGA...5' | 不阻止酶切 |
Cleavage efficiency close to the termini of PCR fragments
| bp from the recognition site tofragment end | ||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| 50-100 | ||||
| Lambda | ΦX174 | M13mp18/19 | pBR322 | puc18/19 | pUC57 |
| 5 | 0 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| pTZ19R/U | pTZ57R | pBluescriptIIKS(-/+) | pBluescriptIISK(-/+) | pACYC177 | pACYC184 |
| 1 | 1 | 1 | 1 | 0 | 1 |
DNA酶切
我们推荐在20 μl反应体系中，用2-10倍过量的限制酶切割0.2-1.5 μg DNA。标准的限制酶切操作方法如下：
1. 按先后顺序添加以下组分：
| 水，无核酸酶 | 16-16.5 µl |
| 10×缓冲液 | 2 µl |
| 底物 DNA | 1 µl (~1 µg) |
| 限制酶 | 0.5-1 µl (5-10 u) |
| 总体积 | 20 µl |
3. 优化反应温度下孵育1-16小时。
备注
a. 酶切反应体系可相应地放大或缩小。
b. 有些限制酶需要添加剂才能达到所描述的活性。在这种情况下，加入添加剂并相应调整水的体积。
PCR产物酶切
PCR产物酶切最方便的途径是在PCR完成后直接将限制酶加入到PCR反应管中。Fermentas公司的大多数限制酶在Fermentas公司的PCR缓冲液中有活性。
然而，在PCR扩增反应液中，PCR产物酶切效率往往不高。因此，酶切时加入的PCR扩增反应液体积不要超过酶切反应总体积的1/3，否则会抑制酶切效率。
1.按先后顺序添加以下组分： PCR 扩增产物 10 µl (~0.1-0.5 µg of DNA)
| PCR反应产物 | 10 µl (~0.1-0.5 µg of DNA) |
| 水，无核酸酶 | 16-17 µl |
| 10× 缓冲液 | 2 µl * |
| 限制酶 | 1-2 µl (10-20 u) |
| 总体积 | 30 µl |
2. 轻轻混匀后短暂离心。
3. 优化反应温度下孵育1-16小时。
备注
a. 克隆应用时，酶切前需重新纯化PCR扩增产物，以除去PCR扩增产物中的嗜热性DNA聚合酶。DNA聚合酶可能会改变酶切后DNA的末端，降低连接产量。
b. 如果限制酶需要特殊的添加剂(如SAM)，需相应调整水的用量。如果PCR扩增产物切割效率不高，酶切前用DNA Gel Extraction Kit 重新纯化PCR扩增产物。
c. 酶切后，用DNA Gel Extraction Kit 纯化PCR扩增产物以除去短片段DNA。因为连接时短片段DNA会与插入片段竞争克隆载体。
双酶切
我们的DoubleDigest™ 搜索引擎是一个非常强大的搜索工具，可以找到满足您需求的双酶切最佳缓冲液和反应条件。该引擎操作简单，只需选定双酶切的限制酶，提交查询即可获得双酶切的推荐说明。DoubleDigest™ 搜索引擎随Fermentas公司新开发限制酶的添加而不断更新。
琼脂糖包埋DNA酶切
1. 1%低熔点琼脂糖包埋底物DNA，包埋比例为1 μg DNA/ 30 μl琼脂糖。
2. 采用GelSyringe® 或类似的琼脂糖剂量分配系统制备~30 μl琼脂糖块。
3. 将琼脂糖块浸入约100 μl 1X酶切缓冲液系统15分钟，平衡琼脂糖块内外的缓冲液系统。
4. 将琼脂糖块浸入100μl新鲜的含有限制酶的1X酶切缓冲液中。
5. 嗜温性酶选用37°C孵育；嗜热性酶选用推荐的50°C、55°C或65°C孵育，酶切时间约4-16小时。
