一、概述

      单核苷酸多态性 ( single nucleotide polymorphisms,SNPs)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP作为一种常见的遗传标记，可用于遗传疾病基因的连锁定位、克隆和鉴定；复杂疾病的关联分析；肿瘤易感基因和热点突变的鉴定；精准医疗；种群进化、迁徙等研究方面有着重要作用。

      对于SNP分型方法有很多，高通量的方法有测序、芯片等；中低通量的方法有定量PCR、引物延伸、溶解曲线等。本项目推荐采用Fluidigm公司的Biomark™ HD 系统进行SNP分型检测。Fluidigm高通量基因分析系统（Bio-Mark™），是集成了流体通路（Integrated Fluidic Circuit，IFC）技术、实时定量PCR技术及强大的基因分析软件的技术平台。IFC 将微流控通道、阀门和反应仓集成在一张芯片上，通过一个控制系统自动完成多达9216个PCR反应。大大降低了手工加样的步骤并减小了误差。IFC系统比传统的384孔板系统能少用99.5%的master mix 试剂却多产生出24倍的数据。

二、Fluidigm SNPs的检测方法介绍

1.Fluidigm技术特点：

      Biomark™ HD系统的核心技术就在于将实时定量技术集成了流体通路技术：利用集成电路制作工艺（光刻）在硅片或石英玻璃上刻有许多微管和微腔体，通过不同的控制阀门控制溶液在其中的流动来实现生物样品的分液、混合，并实现高效准确地实时PCR扩增、检测。

      Biomark™ HD系统配套的检测芯片有如下几种格式，满足不同SNP位点和样本数的研究需求，分别为12*12（12样本*12位点），48*48（48样本*48位点），96*96（96样本*96位点），192*24（192样本*24位点），不同格式检测芯片如图2。

      Fluidigm的SNP检测技术与Taqman类似是基于终端荧光读取判断，每孔采用双色荧光检测一个样本的一个位点可能的两种基因型，不同的SNP模板对应不同的荧光产物。

      (1) 准确度：Juno平台的实验原理与Taqman一样，是基于实时定量PCR的技术手段，基因分型的准确率>99%。[1]

      (2) 特异性：Taqman探针，一般选用8-12bp长度在SNP位点两端设计，可能导致多个同源序列扩增，引起背景增高，杂交信号降低，KASP的引物为24-26bp，特异性更高，SNP call rate 会更高，达到99.9%。

      (3) 成本低：纳升级的反应体系十分节省试剂；对于每一个特定位点单独合成的探针，KASP的非荧光标记的引物，保质期长，而Taqman的针对特定位点的探针是荧光标记的，保质期短，成本高，用不掉会浪费。而KASP荧光标记的Master mix为通用型消耗品，可根据实验用量酌情采购，不会浪费。

      (4) 通量高：一次芯片最多可进行9216个反应。

      (5) 灵活性：选择已有芯片或定制新芯片。任何种属的相应序列，经过预扩增验证后设计探针，有效提高低质量、低浓度或珍贵样本的分析结果。

2.SNP 检测样品要求：

      对于人类基因组，建议最少10μl，浓度60ng/μl。对于大于人类基因组的其它物种的基因组，建议使用specific target amplification(STA)。

3.实验流程：

      从上样到拿到数据只需要3-4小时左右。

三、常见SNP分型方法概述以及与Biomark HD平台比较

1.一代测序（sanger sequencing）

缺点：每个位点均需要经PCR扩增、跑胶，然后切胶纯化，再测序。流程相对复杂，成本较高，工作量大，周期长，不适合大样本多位点检测。同时，一代测序仅能检测频率高于20%的SNP位点。

2.SNaPshot

劣势：操作复杂，每个样品的每个位点都需要PCR预先扩增，跑胶，DNA纯化。对延伸引物要求极高，如每个引物有4-6个碱基差异，不能有互补区段，还要相同条件延伸，除厂家已经验证的少数位点外，很难自己设计针对新位点的检测。步骤分散，费时且易出错，准确性不高。

3.焦***酸测序（pyrosequencing）

劣势：价格昂贵。

4.Taqman探针技术

劣势：价格昂贵（探针合成费用高），仅检测已知SNP位点，通量小，一般为少数几个位点适用，对于样本的质量要求较高，除了样本无降解外，还需要浓度尽可能的一致，这样结果才会比较集中。

5.Microarray芯片法

劣势: 准确度偏低，需要用测序或Taqman探针法进行验证；只能识别已知SNP位点；不适宜多样本、中低SNP位点的检测；价格昂贵。

6.Sequenom MassARRAY

劣势：对于SNP位点两侧序列要求较高，存在特殊序列，如SNP位点，插入缺失等会影响准确性。另外，对于样本质量稍微有些高，后期补数据较为麻烦，如果样本质量不是很好的，建议谨慎选用；单次反应可检测的SNP位点在20-40之间，超过这个数量的位点需要分布在不同的Panel中，增加了成本。

Fluidigm与SNP分型的金标准Taqman的数据具有高度的一致性，在高质量的DNA条件下，能达到99.9%的检出率和99.75%的准确度。

      综上所述：中低通量SNP验证研究（几百~几千样本中，检测几十个SNP位点）选择Fluidigm平台进行检测，在单个SNP位点成本、检测周期，相对于其它检测平台都具有明显的优势。同时，检测灵敏度和准确率与金标准的Taqman具有高度一致性。

服务优势：

• 高通量，成本低：上千样本，几十至数百SNP位点，都可以检测，样本量和位点数越高，每个样本的每个位点检测成本越低。
• 灵敏度高：位点特异性探针，荧光标记的延伸引物，与Taqman金标准吻合度高。
• 时间短：从样本处理到拿到数据3-4个小时。
• 灵活性：任意物种，只要知道目的序列，的探针可以定制。

• 人类基因组研究和药物基因组学研究
• 分子标记辅助育种和家畜遗传标记追踪
• 商业化转基因作物的检测和定量
• 分子标记筛选优良性状的农作物
• 渔业管理和野生动物种类的遗传标记的追踪
• 生物技术服务实验室的遗传鉴定和质控