Illumina 850k (EPIC)甲基化芯片服务

DNA的甲基化修饰是表观遗传研究中的一个热点，在基因调控过程中扮演着重要的角色。它在维持组织特异性表达谱，使细胞获得并保持特定状态中起着重要作用。同时也调控着染色质稳定性、印迹基因表达调控、X染色体失活及抑制病毒和外源基因的表达等生物过程。更重要的是，在许多复杂疾病或生命过程的发生、发展中，也与DNA甲基化对基因的表达调控密切相关，这些疾病包括：癌症、神经系统紊乱、老化以及发育。

 Illumina在原450K芯片巨大成功的基础上，推出了新一代的DNA甲基化芯片Illumina Infinium MethylationEPIC BeadChip芯片（下文中以850K芯片代称），为研究者提供了一个可靠且经济高效的甲基化分析平台。850K芯片可检测人全基因组约853,307个CpG位点的甲基化状态，其中包含了原450K芯片91%的位点，并增加了413,745个位点（图 1）。850K芯片不但保持了对CpG岛，基因启动子区的全面覆盖，还特别加强了增强子区（新增了333,265个探针覆盖来自ENCODE及FANTOM5计划的增强子）以及基因编码区的探针覆盖。广泛应用于干细胞研究、肿瘤和其他复杂疾病研究，是目前最适合表观基因组全关联分析研究的全基因组DNA甲基化芯片。

芯片特点：

·       覆盖全面：检测853,307个CpG位点；全面覆盖CpG岛、启动子、编码区及增强子。

·       无需“甲基化DNA免疫共沉淀”，亚硫酸氢盐处理基因组DNA即可进行芯片实验； Infinium探针设计，直接识别甲基化位点；

·       技术重复重现率>98%；

·       操作简单，无须PCR扩增；模板量可低至250ng；

·       适用于FFPE样品。

图 1 Illumina Infinium MethylationEPIC (850K)芯片与450K芯片的异同

Infinium Methylation EPIC BeadChip芯片对全基因组的全覆盖

      850K芯片对基因组的功能元件提供了空前全面覆盖：CpG岛、RefSeq基因、ENCODE开放染色质、ENCODE转录因子结合区以及FANTOM5增强子。领先的Infinium HD技术的保证了目标区域超高密度覆盖，同时还避免了甲基化DNA捕获方法具有偏向性的缺点。850K芯片的一大特点是增加了很多由ENCODE项目中鉴定出来的潜在增强子。（ENCODE通过全面分析开放染色质、FAIRE实验、转录因子结合区域，整合出基因组中最活跃的区域。）最后，芯片还覆盖了FANTOM5项目鉴定得到的不同组织类型中的增强子。下图及表格统计展示了850K芯片对于不同染色体、基因组功能元件的覆盖及分布。以上的设计不但可从泛-增强子及编码区域角度分析甲基化组，还在全基因组表观遗传关联研究（EWAS）中发挥重要作用。850K芯片中所包含的系列有价值的位点：

·       CpG岛以外的CpG位点

·       人类肝细胞中的非CpG甲基化位点（CHH位点）

·       肿瘤（多种类型的癌症）VS正常样本中的不同甲基化位点，可以检测多种样本类型

·       FANTOM5增强子

·       ENCODE开放染色质和增强子

·       脱氧核糖核酸酶超敏位点

·       miRNA启动子区域

·       涵盖Infinium Methylation 450 BeadChip芯片中的＞90%的内容

图 2 850K芯片探针在不同染色体及基因组功能元件中的分布。

芯片数据的可靠性

      Methylation EPIC BeadChip沿用了在450K芯片中取得成功的Infinium I及II探针设计（Figure 4）,以达到保证数据稳定可靠的同时也达到对目标区域全面覆盖。Infinium II探针对目的CpG位点采用单个探针且序列中包含简并碱基设计，即使序列中有多达三个CpG位点的甲基化状态影响也不会对目的位点的结果造成影响。Illumina的科学家严格检测每个产品，以确保强大而重复的性能，让研究人员能够实现行业领先的数据质量。

（1）Infinium Ⅰ 探针设计

      在InfiniumI设计中对于每个甲基化位点，都对应设计有两种探针：M型磁珠、U型磁珠。M型磁珠尾部为G，用来检测甲基化位点（C）。U型磁珠尾部为A，用来检测未甲基化位点(T)。根据单碱基延伸的原理，仅当探针最后一个碱基与模板配对时，荧光标记的核苷酸才能掺入并被检测到荧光信号。通过分析M型与U型磁珠荧光信号的结果计算甲基化值。

（2）Infinium Ⅱ 探针设计

      Infinium Ⅱ 探针只使用一种磁珠，探针末端为C，与目的位点的前一个碱基配对，只延伸一个碱基（ ddNTP-BioT， ddNTP-DNP）分别与非甲基化或甲基化位点配对。根据两种荧光类型及计算目的位点的甲基化程度。基于Infinium平台的可靠性，850K芯片表现出非常完美的重复相关系数（r2＞0.98），而且850K芯片与450K芯片相同的位点的重复r2＞0.98，为850K与450K数据的整合分析建立了基础。此外通过比较8个生物学样品的重复的结果，850K芯片能可靠检测0.2的delta-beta值，且假阳性率低于1%。此外，芯片中设计了样品依赖和样品不依赖的内参以保证数据的高质量，例如专为亚硫酸氢盐转化后而复杂度降低序列而设计的阴性对照。

图 3 EPIC芯片自身技术重复间的相关性以及与450K相同探针间的相关性R方都在0.98以上。

850K芯片适用于FFPE样品的甲基化研究

      Illumina为FFPE样本的检测改进了protocol，以获得更可靠成稳定的结果。通过与新鲜样本的比较，可见虽然FFPE样本的检出率受到样本质量的影响而下降，但FFPE样本的技术重复的相关性R平方仍然高达0.98。对同一份样本的冰冻样本及FFPE样本的结果比较发现两者相关依然很高（R=0.994）。

图 4 850K芯片用于FFPE样本时的技术重复相关性（R2>0.98）及检出率(>90%)；相同标本分别用FFPE处理与冰冻效果相比，重复相关性（R=0.994）。 

三、样本要求：

样品类型：组织、细胞、基因组DNA

·       样品纯度：OD 260/280值应在1.7～2.0 之间；RNA 应该去除干净；不得有其它个体或其它物种的DNA污染。

·       样品浓度：浓度不低于50ng/μl；

·       样品总量：每个样品总量不少于1μg 。

·       样品溶剂：溶解在TE中。

·       样品运输： DNA低温运输（-20℃）；在运输过程中请用parafilm将管口密封好，以防出现污染。