单细胞测序

概述

单细胞全基因组测序： 是在单细胞水平对全基因组进行扩增与测序的一项新技术。其原理利用MDA或MALBAC技术对分离的单细胞中微量全基因组DNA进行高效扩增，获得高覆盖率的完整的基因组后进行高通量测序用于揭示细胞群体差异和细胞进化关系。

        应用领域

癌症研究、生殖细胞遗传重组研究、胚胎的植入前遗传学诊断研究，基因遗传病等。

单细胞转录组测序： 是在单细胞水平对mRNA进行逆转录和PCR扩增，使用高通量测序手段，对单个细胞中mRNA进行基因表达定量、功能富集、代谢通路等分析，它可以解决传统RNA定量技术在早期备胎发育、干细胞、癌症、免疫等研究领域中存在样本量极低或细胞异质性的问题，主要用于细胞分子机制中细胞异质性研究、以及样本量少而无法进行常规高通量测序等。

应用领域

极微量样品的表达分析（单个细胞）、极微量样品的表达分析（单个细胞）、肿瘤细胞异质性研究、免疫细胞群研究、干细胞分化研究。

单细胞全基因组测序技术流程

单细胞全转录组测序技术流程

单细胞全基因组测序样本要求

1、细胞分离：由合作方完成单细胞分离

2、由公司寄出样品保存液（MALBAC——裂解液；MDA——PBS缓冲液）

3、样品需求量：1-1000个新鲜细胞，样本体积尽量不超过1-2μl。

其它要求

1、直接使用公司提供的0.2mL平盖PCR管作为采集管，管盖标注编号；细胞样本需采用不含Ca2+、Mg2+的缓冲液洗涤；裂解液避免反复冻融。注意避免起泡

2、操作过程中请尽量将采样管置于低温环境下(如冰上)。 样本采集管需要用Parafilm封口膜缠绕封口，装入PCR管盒，橡皮筋固定，再装入自封袋，-80℃暂存，大体积干冰运输；防止液体状态下管身颠倒使细胞附于采样管内壁上部； 

3、送样量：单细胞基因组扩增，建议重复单细胞样本个数不小于3个；

4、细胞采样后，请置于96孔管盒中，避免采样管倾倒，尽快寄送，若需保存请置于-80℃。

单细胞转录组样本要求

1、细胞分离：由合作方完成单细胞分离

2、样品类型：活体新鲜完整细胞；不适于经固定、染色等处理的样本

3、样品体积：在显微镜或其他设备辅助下分离，得到的单细胞样本体积以不高于0.5μl为宜

4、送样量：建议重复单细胞样本个数不小于5个。

其它要求

1、直接使用公司提供的0.2mL平盖PCR管作为采集管，管盖标注编号；细胞样本需采用缓冲液洗涤；裂解液避免反复冻融。注意避免起泡；

2、操作过程中请尽量将采样管置于低温环境下(如冰上)。 样本采集管需要用Parafilm封口膜缠绕封口，装入PCR管盒，橡皮筋固定，再装入自封袋，-80℃暂存，大体积干冰运输；防止液体状态下管身颠倒使细胞附于采样管内壁上部；

3、送样量：单细胞基因组扩增，建议重复单细胞样本个数不小于5个；

4、细胞采样后，请置于96孔管盒中，避免采样管倾倒，尽快寄送，若需保存请置于-80℃。

单细胞全基因组测序​常见问题

Q 单细胞基因组样本的送样要求?

MDA扩增：取样体积越小越好，最多不可超过2μl，公司提供的管中含2μl PBS。

MALBAC扩增：取样体积越小越好，最多不可超过1μl，保证无Ca2+、Mg2+（可以在取样的最后一步用无Ca2+、Mg2+的PBS洗涤），公司提供的管中含4μl裂解液。单细胞基因组样品尽量使细胞之间是独立分离的状态，避免细胞之间有粘连和细胞碎片，影响扩增质量。

Q 单细胞基因组coverage评估?

单细胞全基因组scWGS样品建库后，都需要先试测少量的数据（例：物种-人，数据2G），根据试测的数据用软件进行30X覆盖度的coverage评估，根据评估结果由客户决定是否进行本样品的加测或者重新送样建库。

Q 单细胞基因组扩增方法的原理和优劣?

1、MDA（MultipleDisplacement Amplification）

2001年由Laskin团队发明，使用随机的六聚体引物和φ29 DNA聚合酶进行反应，该聚合酶具有很强的链置换特性，能够在等温的条件下，扩增产生50~100kb的DNA片段。同时由于其3’-5’核酸外切酶活性和校对活性，φ29 DNA聚合酶具有很高的复制保真性。MDA法拥有更高的基因组覆盖度。

2、MALBAC（MultipleAnnealing and Looping–Based Amplification Cycles）

拟线性的扩增过程降低了指数扩增的序列偏好性。扩增引物的5’含有27bp的共同序列，3’是8bp的随机序列，可以和模板在15~20℃的低温下结合，经过8~12个循环的拟线性扩增后，再对这些环状的扩增子进行指数扩增。

MALBAC法的优势在于序列偏好性在不同的细胞之间是可重复的，由于其扩增的均一性更好，其数据更适用于CNV分析。MALBAC的弱点在于，它使用的聚合酶保真性不如φ29，因此MALBAC在检测SNV时将会出现更多的假阳性；另外，由于它可重复性的序列偏好性，基因组上低扩增的区域有时会在扩增过程中丢失。

单细胞转录组测序常见问题

Q 常见的单细胞分选方法及优缺点?

Q 单细胞转录组加入ERCC spike-in control作用。

ERCC 是一种最常用的RNA spike-ins，一共有92个250-2000bp长度的人造的转录本序列，作为外源参照，在细胞RNA 预扩增之前加入一定浓度ERCC，可以评估建库质量和校正基因定量。ERCC需要按照根据样品的细胞中转录组的量确认加入的比例。目前经过测试的1:100000的稀释比例效果较好。

Q 从肿瘤组织样本中分选单细胞的方法。

将肿瘤组织切下后，经机械破碎，酶解，形成单细胞悬浮液，然后用流式细胞仪进行分选。

从肿瘤组织样本中分选单细胞的方法（Anoop P, et al. Science, 2014）