概述
转录组是连接基因组遗传信息与生物功能的必然纽带。真核mRNA测序是基于HiSeq平台,对真核生物特定组织或细胞在某个时期转录出来的所有mRNA进行测序。既可研究已知基因,亦能发掘新基因,全面快速获得mRNA序列和丰度信息。还用于研究基因结构和基因功能、可变剪接和新转录本预测等。转录组研究已经成为揭示生物生长发育调控、逆境胁迫和抗病反应机制的最佳研究手段。真核mRNA测序方法可分为:有参考转录组、无参考转录组及数字基因表达谱(DGE)三大类。
应用
1、环境转录组学;2、发育转录组;3、遗传转录组;4、比较转录组;5、互做转录组学。
技术流程
样本要求
样本类型:去蛋白并经过Dnase处理的总RNA;
RNA样本量:≥5.0 μg
RNA浓度: ≥200 ng/μL
RNA纯度: OD260/280=1.8-2.2,OD260/230 ≥2.0;
动物样本:RIN ≥7.0,植物样本:RIN ≥6.5,28S:18S ≥1.0
策略
常见问题
Q 转录组测序的技术重复性很高,那是否还有必要设生物学重复?
有必要,至少需要两次生物学重复,3次以上的生物学重复更好。2011年7月Hansen发表的文章表明生物学差异是基因自身表达的特性,与检测技术的选择以及数据处理的方式无关。如果不设生物学重复,高影响因子的杂志可能会因此而拒稿。
Q 转录组测序详细的样本要求是怎样的?
合格 | 不合格(建库有风险) | |
RNA | 1. OD260/280≧1.8 2. 28S/18S≧1 (植物参考25S/18S;原核参考23S/16S;特殊样品只有18S可不参考) 真核:总量≧1μg(单次建库),浓度≧50ng/μl 原核:总量≧3μg(单次建库),浓度≧65ng/μl 植物、真菌 RIN值≧6.5 动物 RIN值≧7.0 原核 RIN值≧6.0 (特殊物种,如没有28S,可以不参考,但Agilent 2100 图的基线要平整,RIN值最好可以达到7.0) | N/A 真核:总量 <1μg 原核:总量 <3μg RIN值 <7.0 |
注:1、如果样品OD值未达到要求:可能影响转录组建库时磁珠分离mRNA及反转录效率;可能对基因定量和文库随机性有轻微影响,导致duplication比例高。
2、基因组注释:基因预测、功能基因注释(与Nt、Nr、Swiss-Prot、Interpro等数据进行同源比对)、重复序列分析及Non-coding RNA注释等。
3、基因功能分析:包括GO富集分析、KEGG通路分析等。
4、比较基因组学及进化分析:通过比较相近物种的基因组数据,从基因功能、基因组骨架结构、分子进化等方面对目标物种基因组进行深入分析)。