热点实验服务：RNA干扰整体实验服务（RNAi基因干扰、SiRNA实验）案例介绍

服务名称：	热点实验服务：RNA干扰整体实验服务（RNAi基因干扰、SiRNA实验）案例介绍
提供商：	嘉美

RNA干扰（RNAi基因干扰、SiRNA实验）：RNA干扰（RNA interfering，RNAi）现象是指由与靶基因序列同源的双链RNA(DsRNA)引发的基因转录后的沉默过程，小干扰RNA特异性介导相同序列的mRNA降解，阻断相应基因表达。嘉美生物提供的RAN干扰技术包括化学合成小RNA片段（SiRNA）和构建载体RNA（SnRNA）两种形式。实验委托者只需提供干预基因名称或基因序列ID，嘉美生物免费设计合适的干预位点，保证至少有一对小RNA有效抑制目的基因表达，抑制效率不低于70%。

RNA干扰（SiRNA实验）流程
第一步  确定干扰基因，设计并合成合适的小干扰RNA（片段型或载体型小干扰RNA）。
第二步  预转染实验，进行细胞培养，摸索转染条件、时间并进行必要的检测（WB、PCR等），确定干预效果最佳的一对小RNA。
第三步  正式实验，设置合理实验分组，进行瞬时或稳定转染。
第四步  转染后检测，根据实验要求选择细胞生物学检测、蛋白检测、分子生物学检测等。以研究小干扰RNA对于细胞、蛋白或基因功能的影响。

RNA干扰（SiRNA实验）检测（可根据委托者实验需求选择做）
1. 细胞检测：细胞增殖毒性MTT、细胞凋亡、细胞周期、细胞迁移、细胞侵袭；
2. 蛋白检测：免疫印迹WB、免疫细胞化学ICC、免疫荧光IF、流式细胞术FCM、酶联免疫ELSIA；
3. 分子生物检测：RT-PCR、实时荧光定量PCR、甲基化特异性PCR(MSP)；
4. 其他检测：生化检测、酶类检测、脂类检测、糖类检测。

实验咨询：service@jiamay.com

实验案例： YYYY细胞在XXXX基因干扰后的增殖及侵袭能力实验

第一部分：实验细胞筛选
一、免疫荧光实验
实验试剂 ：PBS(磷酸盐缓冲液pH7.4)，非免疫山羊血清，Triton X-100，BSA抗体稀释液，XXXX蛋白一抗 (1:100)，二抗Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG (H+L) *2 mg/mL*(A21428)
免疫荧光（IF）染色：倒出细胞培养液，PBS冲洗三次；2-4%甲醛固定15分钟；1×PBS缓冲液（0.01 M，pH7.4）洗涤3次，每次5分钟；滴加非免疫山羊血清（内含0.3%Triton X-100）封闭液,覆盖液面2-3mm,室温放置60min，甩去多余液体；滴加一抗plscr1 50μL（1:100），4℃过夜；PBS洗3次，每次5分钟；滴加荧光标记的上述二抗50μL（1：200），室温 60分钟；PBS洗3次各5min；荧光显微镜下观察、拍照，每指标照相2套图像。
IF染色结果（400倍）:通过荧光染色可以分析出，XXXX蛋白在YYYY细胞中表达量最突出。
YYYY细胞 
     
AAAA细胞   
     
BBBB细胞 
      
CCCC细胞
  
 
二、RT-PCR实验
实验材料：细胞样品4份，分组编号（见图片标示）
试剂：Trizol Reagent,Invitrogen  Cat.NO.15596-026；ReverTra Ace-α-TM  First Strand cDNA Synthesis Kit ,TOYOBO #FSK-100；PCR Master Mix（2x） Fermentas # K0172；DNA Marker DL2，000， TaKaRa D501A；0.1% DEPC水、氯仿（分析纯）、异丙醇（分析纯）75%乙醇；AGAROSE(琼脂糖)  AMRESCO，K499；10×DNA上样缓冲液, 美国ProMab,SJ-R2008523；0.5mg/ml EB 溶液，实验室常备；1×TBE, 实验室常备，配方参照《分子克隆实验指南 第二版》
仪器：PCR仪,ABI9600；电泳仪，北京六一仪器公司，DYCP-31DN型；高速离心机，湘仪H1650-W； 紫外分光光度计，上海江仪仪器有限公司，UV-7502C(751)；成像系统，柯达紫外显相系统 400W像素
引物资料：
Homo- XXXX-F    5- cacccatgtctaccaaagtt -3，Homo- XXXX-R    5- ctctcaaaattccagtccag -3，片段长度: 175bp
Homo-GAPDH-F   5-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3，Homo-GAPDH-R   5-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3，片段长度   450bp
实验步骤：
1、RNA提取：每样本加入1ml Trizol试剂消化(组织约50mg—100mg充分剪碎，细胞约106—107)；匀浆样品在室温静置5~10min后加入0.2倍体积的氯仿，震荡15秒后在2~8℃下12,000×g离心15min；将水样层转移至干净的试管，加入0.5倍体积的异丙醇，混匀后-20℃下静置10-15min，在2~8℃下12,000×g离心10min；移去上层悬液，将RNA沉淀用1ml 75%乙醇洗涤，在震荡器上混匀后2~8℃下7,500×g离心5min，弃去上清液；适度干燥RNA沉淀后，加入适量0.1% DEPC水，使RNA完全溶解；2000rpm离心20sec
2、总 RNA 定量：紫外分光光度计开机预热30 min；用蒸馏水洗涤石英比色皿，吸水纸吸干，加入DEPC水后，放入样品室的S池架上，关上盖板；设定紫外光波长（260nm、280nm）后校零（每次检测前均需调零）；将待测样品适当稀释（RNA 1μl用DEPC水稀释至250μl）后，记录编号和稀释度；把装有稀释后待测样品的比色皿放进样品室的S架上，关闭盖板；分别测定260nm和280nm波长时的OD值（吸光度在0.1—0.5范围为最佳）；用蒸馏水洗涤石英比色皿，酒精浸泡。
3、实验结果判断：纯DNA：OD260/OD280≈1.8(＞1.9,表明有RNA污染；＜1.6，表明有蛋白质、酚等污染） 纯RNA：OD260/OD280≈2.0（＜1.7时表明有蛋白质或酚污染；＞2.0时表明可能有异硫氰酸残存）
 

样本编号	稀释倍数	A260	A280	A260/A280	RNA浓度(ug/ul)
YYYY	250	0.348	0.179	1.944	3.48
AAAA	250	0.289	0.151	1.914	2.89
BBBB	250	0.302	0.159	1.899	3.02
CCCC	250	0.333	0.171	1.947	3.33

计算A260/ A280比值，比值≥1.8，满足实验要求。        
RT-PCR实验步骤：略
产物用琼脂糖凝胶电泳检测：扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳,加样量为10μl（DNA样本8μl+上样缓冲液2μl） ,电压120V ,电泳完毕后在溴化乙锭( EB)中染色约15分钟，清水漂洗后凝胶成像系统拍照。
凝胶图片与平均光密度值：阳性条带以Gel pro4.0 版凝胶光密度分析软件进行分析，测其IOD值。

点样说明及IOD参考值分析：
 

泳道	1	2	3	4
样品	YYYY	AAAA	BBBB	CCCC
XXXX基因	15930	8099	10591	12963
R值	0.603	0.325	0.438	0.545
泳道	5	6	7	8
样品	YYYY	AAAA	BBBB	CCCC
GAPDH	26431	24934	24206	23786

R值为目的基因PLSCR1参考IOD值/内参基因GAPDH参考IOD值
XXXX基因在YYYY细胞中表达量最突出。

三、WB实验
实验试剂：XXXX蛋白多抗 (1:400)，37Ka；GAPDH单抗（1:1000）,37Ka；Rabbit Anti Goat IgG/HRP（1:30,000）；Goat Anti mouse IgG/HRP(1:50,000)
WB操作流程：略
实验结果：阳性条带以Gel pro4.0 版凝胶光密度分析软件进行分析，测其IOD（integrated optical density）累积光密度参考值。

 
 

Lanes:	Lane  1	Lane  2	Lane  3	Lane  4
Rows	(IOD)	(IOD)	(IOD)	(IOD)
XXXX	131.69	51.667	65.03	97.148
GAPDH	283.05	282.52	290.29	289.44
样本	YYYY	AAAA	BBBB	CCCC

XXXX蛋白在YYYY细胞中表达量最高。
通过上述实验，确定有YYYY细胞来进行XXXX基因沉默实验最具意义。

第二部分：细胞培养、转染以及siRNA的筛选
一、细胞培养
使用10％胎牛 DMEM培养液，37℃ 下置于5％CO2培养箱中。待细胞融合至80％，用0．25％胰酶消化传代后接种(细胞密度5 XlO4)于培养瓶或孔板，待细胞融合至约70％后用于实验。以下图片均用显微镜100X拍照
YYYY细胞图片如下：
 
1）细胞培养方法：略

二、细胞转染
材料：YYYY细胞；XXXX基因siRNA（20Μm, 合成）；Lipofectamine? 2000试剂（使用前贮存在+4℃）；Opti-MEM I 低血清培养基（使用前37℃预热）；6孔组织培养板
转染步骤：使用Lipofectamine? 2000转染siRNA。转染前一天，4-5×104细胞接种在6孔板上，2mL含FBS的基础培养基；选择用于初期接种的细胞数量，应能在24小时内使细胞汇合达到70%；按照如下的方法准备siRNA- Lipofectamine? 2000复合物：a.以250ul Opti-MEM? I稀释5ul Lipofectamine? 2000，轻轻混匀，室温下孵育5分钟。b.以250ul Opti-MEM? I稀释250pmol siRNA，轻轻混匀。c.孵育5分钟后，混合稀释的siRNA和稀释的Lipofectamine? 2000，轻轻混合，在室温下孵育20分钟，以便允许复合物的形成。溶液可能出现混浊，但是这不会影响转染；将siRNA - LipofectamineTM2000复合物加入到每一个包含细胞和培养基的孔中。通过轻轻地前后摇动培养板混合；6小时后进行FAM-siRNA荧光检测转染率；37℃，CO2培养箱孵育48小时，进行WB，real-time检测。
转染效率检测： 

 

             荧光镜下视野                                   光镜下视野
通过荧光镜下视野与光镜下视野对比可知，细胞的转染效率达到70%以上可以进行后续的WB real-time检测。

三、siRNA最佳浓度筛选
实验分组：A 正常组；B 阴性对照组；C XXXX-1转染组；D XXXX-2转染组；E XXXX-3转染组
第一个筛选实验：荧光定量PCR实验
实验分组：
           

NO	样本编号
1	A
2	B
3	C
4	D
5	E

 
 
 
 
实验试剂：Trizol, Invitrogen ，#15596-026；RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit, Fermentas #K1631；Deoxyribonuclease I (DNase I), Fermentas #EN0521；RiboLock? Ribonuclease Inhibitor, Fermentas #EO0381；SYBR GreenPCR Master Mix，ABI 4309155；Realtime-PCR仪,ABI 7900型；引物由primer3.0软件设计,并由嘉美生物合成。步骤(略)。
结果数据：Ct（基本循环数）；ΔCt（基本循环与内参循环数差值）；ΔΔCt*（最低样本ΔCt值—其它各样本ΔCt值）；2-ΔΔCt（RQ） ：目的基因mRNA相对含量（* 相对定量以含量最低的样本为标准，其余各样本的含量均为相对该样本的倍数.具体方法参见Kenneth，et al. (2001) METHODS 25, 402–408）。
扩增曲线：在实时荧光PCR扩增反应中，荧光扩增曲线主要分为4个特征性阶段：基线期，指数期初期，指数期，平台期，在软件中显示形状是一条平滑的S型曲线。目的基因的扩增曲线符合4个特征性阶段的平滑的S型曲线，阴性对照(模板为水)无显著荧光信号，提示荧光定量PCR反应程序正常运行，目的基因得到有效扩增，实验操作规范，试剂符合实验要求。
熔点曲线：从软件中显示形状只有一个峰值，没有出现杂峰，提示无非特异性荧光信号，目的基因扩增产物单一，有利于结果分析。

 

Sample	CT	ΔCт	ΔΔCт	RQ	RQ mean	SD
1	26.1312	5.7691	-2.2238	4.6712	4.4587	0.6585
1	26.3320	6.0975	-1.8954	3.7203
1	26.0145	5.6754	-2.3175	4.9847
2	27.0101	5.9786	-2.0143	4.0398	3.9841	0.0485
2	27.0077	6.0073	-1.9856	3.9603
2	27.0584	6.0103	-1.9826	3.9520
3	28.1032	8.3378	0.3449	0.7874	0.5186	0.2327
3	28.7212	9.3670	1.3741	0.3858
3	28.5034	9.3785	1.3856	0.3827
4	28.0210	7.8063	-0.1866	1.1381	1.3224	0.2119
4	28.0042	7.6421	-0.3508	1.2753
4	27.9142	7.3570	-0.6359	1.5539
5	26.3742	7.0578	-0.9351	1.9120	2.1770	0.3723
5	26.5004	6.6129	-1.3800	2.6027
5	26.6316	6.9812	-1.0117	2.0163
1-内参	20.3621
1-内参	20.2345
1-内参	20.3391
2-内参	21.0315
2-内参	21.0004
2-内参	21.0481
3-内参	19.7654
3-内参	19.3542
3-内参	19.1249
4-内参	20.2147
4-内参	20.3621
4-内参	20.5572
5-内参	19.3164
5-内参	19.8875
5-内参	19.6504

第二个筛选实验：WB实验
实验试剂：略
WB实验操作流程：略
实验结果：阳性条带以Gel pro4.0 版凝胶光密度分析软件进行分析，测其IOD（integrated optical density）累积光密度参考值。

 

Lanes:	Lane  1	Lane  2	Lane  3	Lane  4	Lane  5
Rows	(IOD)	(IOD)	(IOD)	(IOD)	(IOD)
XXXX	216.21	200.86	60.691	124.52	166.52
GAPDH	299.62	295.32	293.13	307.85	312.45
样本	A	B	C	D	E

以上实验得出XXXX-1干预效果最好，可选择做后续实验。

第三部分：细胞增殖、细胞黏附功能、细胞侵袭、细胞迁移实验
实验分组：A  正常细胞培养组；B  XXXX-1干预组

一、MTT方法检测细胞毒性
原理：MTT分析法以代谢还原噻唑蓝3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT)为基础。活细胞的线粒体中存在与NADP相关的脱氢酶，可将黄色的MTT还原为不溶性的蓝紫色的甲月赞（Formazan），死细胞此酶消失，MTT不被还原。 用DMSO溶解Formazan后可用酶标仪在570nm(450nm)波长处检测光密度。
操作步骤：在96孔板加入细胞100μL/孔（约1×104），置37℃ 5%CO2细胞培养箱培养24小时；加入适当浓度的受试化合物；将96孔板在37℃，含5% CO2空气及100%湿度的细胞培养箱中孵育适当时间；将5×MTT用 Dilution Buffer稀释成1× MTT；每孔加50μL 1× MTT，在37℃孵育4小时，使MTT还原为甲月赞；吸出上清液，每孔加150μL DMSO使甲月赞溶解，用平板摇床摇匀；酶标仪在570nm波长处检测每孔的光密度。
结果分析：细胞存活率% =（加药细胞OD-本地OD/对照细胞OD-本地OD）×100％。注：本底OD值（完全培养基加MTT，无细胞）
0h 570nm波长各孔OD值：
 

实验分组	样品	平行样品	平行样品	平均值
A	0.457	0.452	0.463	0.457
B	0.461	0.448	0.454	0.454
本底	0.007	0.009	0.010	0.009

12h 570nm波长各孔OD值：
 

实验分组	样品	平行样品	平行样品	平均值
A	0.503	0.518	0.511	0.511
B	0.494	0.501	0.489	0.495
本底	0.009	0.012	0.011	0.011

24h 570nm波长各孔OD值：
 

实验分组	样品	平行样品	平行样品	平均值
A	0.618	0.607	0.624	0.616
B	0.573	0.566	0.584	0.574
本底	0.007	0.008	0.008	0.008

48h 570nm波长各孔OD值：
 

实验分组	样品	平行样品	平行样品	平均值
A	0.744	0.765	0.738	0.749
B	0.636	0.663	0.657	0.652
本底	0.009	0.008	0.008	0.008

72h 570nm波长各孔OD值：
 

实验分组	样品	平行样品	平行样品	平均值
A	0.821	0.817	0.834	0.824
B	0.701	0.724	0.695	0.707
本底	0.013	0.008	0.009	0.010

 

 
二、细胞粘附能力实验
试剂耗材及仪器设备：结晶紫染色液；1×PBS, 实验室常备，配方参照《分子克隆实验指南 第二版》；仪器：美国bio-rad公司酶标仪 #680
操作步骤:采用结晶紫染色法测定。将Fn和Ln用1×PBS液分别稀释成100μg/ml和200μg/ml，以每孔100μl分别包被96孔板；37℃包被2h，用1×PBS洗涤2次，再用1% BSA封闭2h。；将各组细胞按常规方法收集后用无血清培养基制成单细胞悬液，每个样本计数3次取平均数，调节细胞浓度为3×105个/ml，以每孔200μl加入包被好的培养板中，置37℃，5%CO2培养箱中孵育2h；取出96孔板，轻轻洗去未粘附的细胞，每孔用100μl 4%中性甲醛固定，30分钟后洗去；每孔加100μl 0.5%结晶紫，室温染色2h,，蒸馏水洗涤一次，阴干后每孔加入100μl 2% SDS溶液，放置酶标仪中570nm波长测定各孔OD值。
检测结果：
0h  570nm波长各孔OD值：
Ln OD值
 

分组	样品	平行样品	平行样品	平均值
A	0.586	0.563	0.592	0.580
B	0.575	0.580	0.577	0.577

Fn OD值
 

分组	样品	平行样品	平行样品	平均值
A	0.649	0.633	0.654	0.645
B	0.627	0.641	0.638	0.635

12h  570nm波长各孔OD值：
Ln OD值
 

分组	样品	平行样品	平行样品	平均值
A	0.594	0.584	0.571	0.583
B	0.546	0.543	0.558	0.549

Fn OD值
 

分组	样品	平行样品	平行样品	平均值
A	0.656	0.639	0.643	0.646
B	0.609	0.611	0.603	0.608

24h  570nm波长各孔OD值：
Ln OD值
 

分组	样品	平行样品	平行样品	平均值
A	0.602	0.591	0.603	0.599
B	0.511	0.508	0.502	0.507

Fn OD值
 

分组	样品	平行样品	平行样品	平均值
A	0.671	0.665	0.653	0.663
B	0.563	0.574	0.585	0.574

48h  570nm波长各孔OD值：
Ln OD值
 

分组	样品	平行样品	平行样品	平均值
A	0.575	0.582	0.586	0.581
B	0.474	0.463	0.481	0.473

Fn OD值
 

分组	样品	平行样品	平行样品	平均值
A	0.648	0.659	0.661	0.656
B	0.521	0.516	0.534	0.524

72h  570nm波长各孔OD值：
Ln OD值
 

分组	样品	平行样品	平行样品	平均值
A	0.569	0.573	0.568	0.570
B	0.392	0.407	0.384	0.394

Fn OD值
 

分组	样品	平行样品	平行样品	平均值
A	0.636	0.641	0.652	0.643
B	0.489	0.476	0.486	0.484

 
三、细胞侵袭实验
实验材料：Corning公司:Transwell 6孔板，孔径8um. BD公司:基底膜Matrigel
Transwell小室制备：在上室的聚碳酸酯膜上加入稀释后的Matrigel (3.9ug/ul) 60-80μl，置37℃ 30min使Matrigel聚合成凝胶。
制备细胞悬液：消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1－2遍，用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至5×104/ml。
接种细胞：6孔板下室加入1ml含FBS的培养基。上室加入细胞悬液，培养细胞。
结果统计：用棉签擦去基质胶和上室内的细胞；用95%酒精固定15-20min；HE染色10分钟；细胞计数：取5个视野于倒置显微镜观察照相（放大倍数400）
A  

平均107个细胞
B 

平均66个细胞
A 

平均98个细胞
B 

平均54个细胞
A  

平均103个细胞
B 

平均61个细胞

四、细胞迁移实验
材料：Corning公司:Transwell 6孔板，孔径8um.
制备细胞悬液：消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1－2遍，用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至5×104/ml。
接种细胞：6孔板下室加入1ml含FBS的培养基；取细胞悬2ml加入Transwell小室；培养细胞：常规培养24h。
结果统计：用棉签擦去上室内的细胞；用95%酒精固定15-20min；HE染色10分钟；细胞计数：取5个视野于倒置显微镜观察照相（放大倍数400）
A  

平均119个细胞
B 

平均54个细胞
A  

平均115个细胞
B 

平均52个细胞
A  

平均121个细胞
B 

平均43个细胞

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