热点实验服务：PKC蛋白激酶活性检测实验服务案例介绍

服务名称：	热点实验服务：PKC蛋白激酶活性检测实验服务案例介绍
提供商：	嘉美

实验试剂：琼脂糖（Promega公司，V3125）；其他常备试剂购自sigma公司；PKC活性检测试剂盒（Promega公司， V5330）
实验仪器：电泳仪（北京六一厂，112-0640）；水平电泳槽（北京六一厂，122-3146）；电热恒温培养箱（碧云天生物，EBI025）；电热恒温水浴锅（江苏省金坛市环宇科学仪器厂，HH-8）
基本原理：分离PKC蛋白（磷酸化蛋白及非磷酸化蛋白），利用试剂盒组分将2种蛋白分离并加以区分，利用电泳琼脂糖凝胶技术显示2种不同的蛋白，利用分析软件将显示的不同蛋白定量并加以比较，以磷酸化PKC非磷酸化PKC灰度值IOD的比值显示PKC活性（PKC活化度）。

操作步骤：
1．用预冷的匀浆器把细胞匀浆。
2．在4℃，用14,000 × g 离心裂解液5 分钟，保存上清。
3．用PKC 抽提液预平衡1ml 的DEAE 纤维素柱，再把第2 步中得到的上清过柱。用5ml的PKC 抽提液洗柱子，然后用5ml 含有200mM NaCl 的PKC 抽提液洗脱含有PKC 的组分。
4．用PKC 稀释液（PKC dilution buffer）将少量蛋白激酶C（Promtein Kinase C）稀释到2.5ug/ml。随试剂盒所附的产品信息中标有这个酶的初始浓度。
5．用探头超声波破碎仪超声处理PKC Activator Solution 20-30 秒，或直到溶液变温暖。
6．对每一个样品，按照下面所列顺序在0.5ml 小离心管中混合PepTag® PKC 5× Buffer,PepTag® C1 Peptide，超声过的PKC Activator 5X Solution，和水。在样品加入之前，小离心管一直要放在冰上。阴性对照将用于对反应进行定量时确定其摩尔吸收值（说明书第IV.部分）。

标准PKC检测
PepTag® PKC Reaction 5X Buffer                        5ul
PepTag® C1 Peptide (0.4ug/ul)                         5ul
PKC Activator 5X Solution, 超声处理的                  5ul
短肽保护液（非必须）                                   1ul
样品                                                  9ul
去离子水使终体积为                                     25ul

PKC阳性对照检测 
PepTag® PKC Reaction 5X Buffer                        5ul
PepTag® C1 Peptide (0.4ug/ul)                         5ul
PKC Activator 5XSolution, 超声处理的                   5ul
短肽保护液（非必须）                                    1ul
Protein Kinase C (2.5ug/ml 溶于 PKC dilution buffer）  4ul
去离子水使终体积为                                     25ul

PKC阴性对照检测（不加PKC）
PepTag® PKC Reaction 5X Buffer                        5ul
PepTag® C1 Peptide (0.4ug/ul)                         5ul
PKC Activator 5XSolution, 超声处理的                   5ul
短肽保护液（非必须）                                    1ul
去离子水使终体积为                                     25ul

7．在0 时间点，把一支管子从冰上移到30℃水浴中孵育2 分钟。然后加入样品或蛋白激酶C 在30℃ 再孵育30 分钟。
8．把管子放进开水浴或95℃ 加热块10 分钟以终止反应。在凝胶电泳前把样品一直避光存放在4℃ 或-20℃。
9．把样品上样到胶上之前，往每个样品中加进1ul 的80％甘油，以确保样品保留在上样孔中（说明书第III.F 部分）。
10．每孔点样10ul，在0.8% 琼脂糖凝胶上以100V电泳15分钟分开样品，拍照。

检测结果：
说明：后面2组泳道“阳性(PC)”和“阴性(NC)”为试剂盒自带系统对照。
注：阳性条带以Gel pro4 版凝胶光密度分析软件进行分析，测其IOD（integrated optical density）累积光密度参考值。按照百分比例计算PKC活性百分比
（以阳性对照IOD值为100，其余各组的PKC+ p-PKC总和为100分配IOD数值）


 

Lanes:	Lane 1	Lane 2	Lane 3	Lane 4	Lane 5	Lane 6	Lane PC
Rows	( % )	( % )	( % )	( % )	( % )	( % )	( % )
PKC	77.082	75.616	88.98	66.975	77.93	74.645	100
p-PKC	22.918	24.384	11.02	33.025	22.07	25.355	0
Sum	100	100	100	100	100	100	100
p-PKC:PKC	0.29732	0.322471	0.123848	0.493094	0.283203	0.339674	0
样本	#1	#2	#3	#4	#5	#6	PC

 
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